Разработка платформы для экспонирования гетерологичных белков на поверхности клеток дрожжей
|
Список сокращений
Введение
Дрожжевой дисплей - передовое направление современной биотехнологии (обзор литературы)
История развития технологий иммобилизации белков
Области применения дрожжевого дисплея
Состав и структура клеточной стенки дрожжей
Якорные белки S. cerevisiae,используемые для дрожжевого дисплея
Другие виды дрожжей, используемые в дрожжевом дисплее
Дрожжи P. pastorisи их применение в дрожжевом дисплее
Кислая фосфатаза Pho5p S. cerevisiae,как потенциальный якорный белок для
дрожжевого дисплея
Цель и задачи работы
Материалы и методы
Результаты
Конструирование штаммов, использующих Pirlp P. pastorisи S. cerevisiae,вкачестве якорного белка
Конструирование штаммов, использующих сигнальную последовательность Pho5p
S. cerevisiae 42
Изучение эффективности систем дрожжевого дисплея на основе белков Pirl
Поиск новых якорных последовательностей
Сравнение кислых фосфатаз Pho5p S. cerevisiaeи Pholp P. pastoris
Изучение сигнальной последовательности Pho5p
Поиск домена, отвечающего за закрепление белка Pho5 на поверхности клетки ...50
Заключение 59
Выводы
Список литературы
Благодарности
Введение
Дрожжевой дисплей - передовое направление современной биотехнологии (обзор литературы)
История развития технологий иммобилизации белков
Области применения дрожжевого дисплея
Состав и структура клеточной стенки дрожжей
Якорные белки S. cerevisiae,используемые для дрожжевого дисплея
Другие виды дрожжей, используемые в дрожжевом дисплее
Дрожжи P. pastorisи их применение в дрожжевом дисплее
Кислая фосфатаза Pho5p S. cerevisiae,как потенциальный якорный белок для
дрожжевого дисплея
Цель и задачи работы
Материалы и методы
Результаты
Конструирование штаммов, использующих Pirlp P. pastorisи S. cerevisiae,вкачестве якорного белка
Конструирование штаммов, использующих сигнальную последовательность Pho5p
S. cerevisiae 42
Изучение эффективности систем дрожжевого дисплея на основе белков Pirl
Поиск новых якорных последовательностей
Сравнение кислых фосфатаз Pho5p S. cerevisiaeи Pholp P. pastoris
Изучение сигнальной последовательности Pho5p
Поиск домена, отвечающего за закрепление белка Pho5 на поверхности клетки ...50
Заключение 59
Выводы
Список литературы
Благодарности
В 1980 годах была изобретена методика экспонирования антител на
поверхности нитевидных фагов, она получила название фаговый дисплей. Эта
методика позволяла эффективно отбирать специфичные к определенному антигену
антитела и до сих пор широко применяется. Однако, в виду небольших размеров
вирусов и их геномов, помещать на их поверхность крупные белки оказалось
невозможно. Тогда для экспонирования более крупных белков стали использовать
клетки бактерий. Недостатком бактериальных систем является их неспособность
производить многие белки эукариот, поэтому для экспонирования эукариотических
белков стали использовать дрожжи (Sheehan, Marasco, 2015; Ueda, 2016). Дрожжевой
дисплей имеет широкий спектр приложений начиная от переработки отходов
производств, например, целлюлозы, крахмала или других высокомолекулярных
соединений, заканчивая чисто исследовательскими методами анализа белок-белковых
взаимодействий (Shibasaki et al., 2009; Andreu, Olmo del, 2018).
Для дрожжевого дисплея используют разные виды дрожжей. Особый интерес
среди них представляют метилотрофные дрожжи Pichia pastoris, получившие широкое
распространение в биотехнологии. Дрожжи P. pastoris способны расти на средах
достаточно простого состава и при этом достигать высоких значений плотности
культуры, так как они являются облигатными аэробами. Среди других преимуществ
дрожжей P. pastoris можно выделить наличие сильных и при этом строго
регулируемых промоторов, например, промотор гена AOX1, индуцируемого наличием
метанола в среде. Эти факторы сделали P. pastoris одной из самых эффективных из
известных систем экспрессии гетерологичных генов. Существует ряд примеров
успешного синтеза белков дрожжами P. pastoris, которые ранее не удавалось
синтезировать с помощью других систем (Cregg et al., 1993). Все это делает P. pastoris
очень перспективным объектом для использования в дрожжевом дисплее.
Для конструирования эффективных систем дрожжевого дисплея необходимо
правильно подобрать сразу несколько компонентов: промотор, сигнальную
последовательность и якорный белок, участвующий в закреплении целевого белка на
поверхности клетки. От них будет зависеть общий уровень синтеза целевого белка, а
также его стабильность и активность. В связи с этим, поиск новых сигнальных
последовательностей и якорных белков представляет собой чрезвычайно важную5
задачу. В данной работе была исследована возможность применения сигнальной
последовательности белка Pho5 Saccharomyces cerevisiae для секреции
рекомбинантных белков в P. pastoris, а также сделаны первые шаги в поиске якорного
домена белка Pho5.
поверхности нитевидных фагов, она получила название фаговый дисплей. Эта
методика позволяла эффективно отбирать специфичные к определенному антигену
антитела и до сих пор широко применяется. Однако, в виду небольших размеров
вирусов и их геномов, помещать на их поверхность крупные белки оказалось
невозможно. Тогда для экспонирования более крупных белков стали использовать
клетки бактерий. Недостатком бактериальных систем является их неспособность
производить многие белки эукариот, поэтому для экспонирования эукариотических
белков стали использовать дрожжи (Sheehan, Marasco, 2015; Ueda, 2016). Дрожжевой
дисплей имеет широкий спектр приложений начиная от переработки отходов
производств, например, целлюлозы, крахмала или других высокомолекулярных
соединений, заканчивая чисто исследовательскими методами анализа белок-белковых
взаимодействий (Shibasaki et al., 2009; Andreu, Olmo del, 2018).
Для дрожжевого дисплея используют разные виды дрожжей. Особый интерес
среди них представляют метилотрофные дрожжи Pichia pastoris, получившие широкое
распространение в биотехнологии. Дрожжи P. pastoris способны расти на средах
достаточно простого состава и при этом достигать высоких значений плотности
культуры, так как они являются облигатными аэробами. Среди других преимуществ
дрожжей P. pastoris можно выделить наличие сильных и при этом строго
регулируемых промоторов, например, промотор гена AOX1, индуцируемого наличием
метанола в среде. Эти факторы сделали P. pastoris одной из самых эффективных из
известных систем экспрессии гетерологичных генов. Существует ряд примеров
успешного синтеза белков дрожжами P. pastoris, которые ранее не удавалось
синтезировать с помощью других систем (Cregg et al., 1993). Все это делает P. pastoris
очень перспективным объектом для использования в дрожжевом дисплее.
Для конструирования эффективных систем дрожжевого дисплея необходимо
правильно подобрать сразу несколько компонентов: промотор, сигнальную
последовательность и якорный белок, участвующий в закреплении целевого белка на
поверхности клетки. От них будет зависеть общий уровень синтеза целевого белка, а
также его стабильность и активность. В связи с этим, поиск новых сигнальных
последовательностей и якорных белков представляет собой чрезвычайно важную5
задачу. В данной работе была исследована возможность применения сигнальной
последовательности белка Pho5 Saccharomyces cerevisiae для секреции
рекомбинантных белков в P. pastoris, а также сделаны первые шаги в поиске якорного
домена белка Pho5.
Дрожжевой дисплей широко применяется в современной биотехнологии для
производства биотоплива, различных химических соединений, а также для белковой
инженерии. Среди дрожжей, используемых для дрожжевого дисплея, особое внимание
привлекают метилотрофные дрожжи P. pastoris. Они являются чрезвычайно
перспективной системой синтеза гетерологичных белков. Расширение набора
доступных методик и подходов для дрожжевого дисплея в дрожжах P. pastoris
позволит еще больше повысить их значимость в биотехнологии. Ряд подходов
используемых для наиболее изученного вида дрожжей S. cerevisiae был также
применен для P. pastoris. В частности, использование якорных белков семейства Pir
для конструирования систем иммобилизации белков на поверхности клеток.
Основываясь на уже известных данных, в нашей работе планировалось сравнить
эффективность использования Pir1p из S. cerevisiae и P. pastoris в качестве якорных
белков в P. pastoris. Однако, несмотря на то что в некоторых случаях процесс
конструирования досконально повторял описанные ранее эксперименты (Wang et al.,
2008), выяснилось, что результаты, приведенные в этих статьях не воспроизводятся.
Для штаммов GS115-ScPIR1-1, GS115-PpPIR1-1, GS115-PpPIR1-2 было показано
отсутствие синтеза EGFP. Штамм GS115-ScPIR1-2 синтезировал EGFP, однако
количество белка было заметно ниже по сравнению с контрольным секреторным
вариантом EGFP. Эти результаты свидетельствуют о необходимости поиска новых якорных белков.
Ранее в нашей лаборатории была сконструирована репортерная система для
изучения регуляции промотора гена AOX1 P. pastoris на основе репортерного гена
PHO5 S. cerevisiae (Савинов и др., 2009). В данной работе используя штамм GS115-
pAOX1-PHO5 мы показали, что белок Pho5 локализован преимущественно на
поверхности клеток дрожжей P. pastoris. Эти результаты согласуются с данными,
полученными для S. cerevisiae (Linnemans et al., 1977).
Дрожжи P. pastoris имеют собственную репрессибельную кислую фосфатазу
Pho1p. Нами было показано, что она также локализуется на поверхности клеток
P. pastoris. Для Pho5p S. cerevisiae ранее были описаны границы и расположение
сигнальной последовательности (Arima et al., 1983). Поскольку Pho5p эффективно
секретируется на поверхность клеток P. pastoris, мы изучили возможность применения
этой сигнальной последовательности для секреции рекомбинантных белков при60
синтезе в P. pastoris. Для этого 35 аминокислот с N-конца Pho5p были добавлены к
флуоресцентному белку EGFP и было показано, что химерный белок эффективно
синтезируется и секретируется в культуральную среду. Предположительно при этом
сигнальная последовательность отрезается в процессе секреции белка. Таким образом
мы показали, что, несмотря на значимые различия в аминокислотных
последовательностях Pho1p P. pastoris и Pho5p S. cerevisiae, Pho5p активно
синтезируется и секретируется в клетках P. pastoris. Также, оба этих белка
локализуются на поверхности клетки, что говорит о сходных механизмах процессинга
кислых фосфатаз у этих видов дрожжей.
Следующим этапом работы был поиск доменов кислой фосфатазы Pho5p,
участвующих в ее закреплении на поверхности клетки. На первом этапе было
произведено укорачивание белка Pho5 с N-конца, при этом собственная сигнальная
последовательность была полностью или частично заменена на сигнальную
последовательность α-фактора S. cerevisiae. Частичное удаление сигнальной
последовательности Pho5p приводило к значимому снижению активности кислой
фосфатазы, как на поверхности клеток, так и в среде. Это можно объяснить тем, что
оставшийся фрагмент сигнальной последовательности Pho5p, включающий в себя сайт
протеолиза, находясь рядом с сигнальным пептидом α-фактора нарушает процессинг
белка. Полная замена собственной сигнальной последовательности приводила к
снижению уровня активности кислой фосфатазы на поверхности клеток. При этом ее
активность в среде возрастала, по сравнению с контрольным штаммом,
синтезирующим Pho5p с нативной сигнальной последовательностью. Также было
показано, что в случае отсутствия какой бы то ни было сигнальной последовательности
кислая фосфатаза Pho5p при синтезе в P. pastoris не только перестает секретироваться
в среду, но и полностью теряет свою активность. В литературе описано схожее
поведение Pho5p без сигнальной последовательности при синтезе S. cerevisiae (Silve et
al., 1987; Monod et al., 1989).
Так как дальнейшее укорочение кислой фосфатазы Pho5p с N-конца приводит к
потере ее активности, дальнейший поиск якорного домена проводили за счет
укорочения C-конца белка с присоединением репортерного белка β-галактозидазы.
Присоединение β-галактозидазы к полноразмерному белку Pho5p приводило к
значимому уменьшению активности кислой фосфатазы. Сама β-галактозидаза при этом
была неактивна. Также ее активности не наблюдалось и в химерных белках с более
короткими фрагментами Pho5p. В дрожжах S. cerevisiae β-галактозидаза часто61
используется в качестве секретируемого репортера. Однако, в ряде работ было
показано, что β-галактозидаза не всегда активна в составе химерного белка (Emr et al.,
1984). Судя по всему, в нашем случае β-галактозидаза не является подходящим
репортерным белком. Исследования по поиску якорного домена Pho5p будут
продолжены с использованием других вариантов репортерных систем
производства биотоплива, различных химических соединений, а также для белковой
инженерии. Среди дрожжей, используемых для дрожжевого дисплея, особое внимание
привлекают метилотрофные дрожжи P. pastoris. Они являются чрезвычайно
перспективной системой синтеза гетерологичных белков. Расширение набора
доступных методик и подходов для дрожжевого дисплея в дрожжах P. pastoris
позволит еще больше повысить их значимость в биотехнологии. Ряд подходов
используемых для наиболее изученного вида дрожжей S. cerevisiae был также
применен для P. pastoris. В частности, использование якорных белков семейства Pir
для конструирования систем иммобилизации белков на поверхности клеток.
Основываясь на уже известных данных, в нашей работе планировалось сравнить
эффективность использования Pir1p из S. cerevisiae и P. pastoris в качестве якорных
белков в P. pastoris. Однако, несмотря на то что в некоторых случаях процесс
конструирования досконально повторял описанные ранее эксперименты (Wang et al.,
2008), выяснилось, что результаты, приведенные в этих статьях не воспроизводятся.
Для штаммов GS115-ScPIR1-1, GS115-PpPIR1-1, GS115-PpPIR1-2 было показано
отсутствие синтеза EGFP. Штамм GS115-ScPIR1-2 синтезировал EGFP, однако
количество белка было заметно ниже по сравнению с контрольным секреторным
вариантом EGFP. Эти результаты свидетельствуют о необходимости поиска новых якорных белков.
Ранее в нашей лаборатории была сконструирована репортерная система для
изучения регуляции промотора гена AOX1 P. pastoris на основе репортерного гена
PHO5 S. cerevisiae (Савинов и др., 2009). В данной работе используя штамм GS115-
pAOX1-PHO5 мы показали, что белок Pho5 локализован преимущественно на
поверхности клеток дрожжей P. pastoris. Эти результаты согласуются с данными,
полученными для S. cerevisiae (Linnemans et al., 1977).
Дрожжи P. pastoris имеют собственную репрессибельную кислую фосфатазу
Pho1p. Нами было показано, что она также локализуется на поверхности клеток
P. pastoris. Для Pho5p S. cerevisiae ранее были описаны границы и расположение
сигнальной последовательности (Arima et al., 1983). Поскольку Pho5p эффективно
секретируется на поверхность клеток P. pastoris, мы изучили возможность применения
этой сигнальной последовательности для секреции рекомбинантных белков при60
синтезе в P. pastoris. Для этого 35 аминокислот с N-конца Pho5p были добавлены к
флуоресцентному белку EGFP и было показано, что химерный белок эффективно
синтезируется и секретируется в культуральную среду. Предположительно при этом
сигнальная последовательность отрезается в процессе секреции белка. Таким образом
мы показали, что, несмотря на значимые различия в аминокислотных
последовательностях Pho1p P. pastoris и Pho5p S. cerevisiae, Pho5p активно
синтезируется и секретируется в клетках P. pastoris. Также, оба этих белка
локализуются на поверхности клетки, что говорит о сходных механизмах процессинга
кислых фосфатаз у этих видов дрожжей.
Следующим этапом работы был поиск доменов кислой фосфатазы Pho5p,
участвующих в ее закреплении на поверхности клетки. На первом этапе было
произведено укорачивание белка Pho5 с N-конца, при этом собственная сигнальная
последовательность была полностью или частично заменена на сигнальную
последовательность α-фактора S. cerevisiae. Частичное удаление сигнальной
последовательности Pho5p приводило к значимому снижению активности кислой
фосфатазы, как на поверхности клеток, так и в среде. Это можно объяснить тем, что
оставшийся фрагмент сигнальной последовательности Pho5p, включающий в себя сайт
протеолиза, находясь рядом с сигнальным пептидом α-фактора нарушает процессинг
белка. Полная замена собственной сигнальной последовательности приводила к
снижению уровня активности кислой фосфатазы на поверхности клеток. При этом ее
активность в среде возрастала, по сравнению с контрольным штаммом,
синтезирующим Pho5p с нативной сигнальной последовательностью. Также было
показано, что в случае отсутствия какой бы то ни было сигнальной последовательности
кислая фосфатаза Pho5p при синтезе в P. pastoris не только перестает секретироваться
в среду, но и полностью теряет свою активность. В литературе описано схожее
поведение Pho5p без сигнальной последовательности при синтезе S. cerevisiae (Silve et
al., 1987; Monod et al., 1989).
Так как дальнейшее укорочение кислой фосфатазы Pho5p с N-конца приводит к
потере ее активности, дальнейший поиск якорного домена проводили за счет
укорочения C-конца белка с присоединением репортерного белка β-галактозидазы.
Присоединение β-галактозидазы к полноразмерному белку Pho5p приводило к
значимому уменьшению активности кислой фосфатазы. Сама β-галактозидаза при этом
была неактивна. Также ее активности не наблюдалось и в химерных белках с более
короткими фрагментами Pho5p. В дрожжах S. cerevisiae β-галактозидаза часто61
используется в качестве секретируемого репортера. Однако, в ряде работ было
показано, что β-галактозидаза не всегда активна в составе химерного белка (Emr et al.,
1984). Судя по всему, в нашем случае β-галактозидаза не является подходящим
репортерным белком. Исследования по поиску якорного домена Pho5p будут
продолжены с использованием других вариантов репортерных систем