Введение
1. Обзор литературы.
1.1 Систематическое положение и биология Mycoplasma hominis
1.1.1 Геном M. hominis
1.1.2 Морфология M. hominis
1.1.3 Метаболизм M. hominis
1.1.3.1 Системы транспорта питательных веществ и минеральных солей
1.2 Особенности M. hominis, связанные с её патогенностью
1.2.1 Адгезия M. hominis к клеткам хозяина
1.2.2 Взаимодействие M. hominis с иммунной системой и антигенная изменчивость....... 14
1.2.3 Адаптация M. hominis к получению питательных веществ в организме хозяина ..... 15
1.2.4 Развитие внутриклеточной инфекции M. hominis
1.2.5 Внутривидовые различия патогенных свойств M. hominis
1.3 Устойчивость M. hominis к противомикробным препаратам
1.4 Структура фторхинолонов и особенности развития резистентности к ним у
патогенных для человека микоплазм
1.4.1 Мишени фторхинолонов
1.4.2 Факторы устойчивости бактерий к фторхинолонам
1.4.3 Особенности развития устойчивости к фторхинолонам у представителей вида M.
hominis
2. Материалы и методы
2.1 Объект исследования
2.2 Культивирование M. hominis
2.3 Определение минимальных подавляющих концентраций
2.4 Выделение ДНК
2.5 Полимеразная цепная реакция
2.6 Выделение ДНК из геля
2.7 Секвенирование ДНК
2.8 Обработка данных секвенирования
2.9 U-критерий Уилкоксона – Манна – Уитни
3. Результаты
3.1 Культивирование изолятов M. hominis и определение минимальной подавляющей
концентрации (МПК)
3.2 Оптимизация ПЦР и очистка ампликонов
3.3 Анализ результатов секвенирования
3.4 Оценка связи выявленных мутаций с устойчивостью к фторхинолонам
4. Обсуждение
Выводы
Список литературы
Приложение 1.
Более десятка видов микоплазм могут обитать в организме человека. Среди них
есть патогенные виды, Mycoplasma pneumoniae и M. genitalium, а также условнопатогенные микоплазмы: M. fermentans, M. penetrans, M. spermatophilum и M. hominis. В
организме человека микоплазмы преимущественно колонизируют органы мочеполовой и
дыхательной систем.
M. hominis является условно-патогенной бактерией и в здоровом организме обитает
в урогенитальном тракте в качестве комменсала. Главным образом, она ассоциирована с
развитием различных болезней мочеполовой системы, например, таких как
бактериальный вагиноз, воспалительные заболевания органов малого таза, бесплодие. В
редких случаях M. hominis может распространяться в организме, заселяя другие ткани и
органы, в результате чего спектр вызываемых заболеваний расширяется до септицемии,
артрита и других болезней. При этом M. hominis представляет собой серьёзную угрозу для
беременных женщин и плода, поскольку она может вызвать ряд тяжёлых нарушений,
включая задержку развития плода и мертворождение. У новорождённых детей она
является причиной развития менингита, пневмонии, хронической болезни лёгких и
различных абсцессов. Наиболее остро проявляются патогенные свойства M. hominis у
людей с ослабленным иммунитетом.
Несмотря на то, что M. hominis участвует в развитии довольно широкого круга
заболеваний, причины, по которым она превращается из комменсала в патогена, до сих
пор до конца не изучены. M. hominis характеризуется генетической гетерогенностью, и
геномы её изолятов могут довольно сильно различаться между собой. За счёт антигенной
вариабельности M. hominis уклоняется от иммунитета хозяина и занимает новые ниши в
организме. Всё это приводит к затруднению оценки её патогенного потенциала.
Высокая частота мутаций, характерная для M. hominis, вносит существенный вклад
в развитие устойчивости к антибиотикам и противомикробным соединениям, которые
применяются для лечения микоплазмозов. Выбор препаратов для борьбы с микоплазмами
ограничен особенностями их цитологии и физиологии, например, на них не действуют
соединения, относящиеся к бета-лактамам и сульфаниламидам. Для лечения заболеваний
человека, вызванных микоплазмами, в основном применяют макролиды, фторхинолоны и
тетрациклины, но в последнее время наблюдается значительное снижение их
эффективности. Применение макролидов в качестве препаратов первой линии6
определяется их низкой токсичностью, благодаря которой их можно назначать в детском
возрасте и при беременности. В качестве препаратов второй линии обычно рассматривают
фторхинолоны и тетрациклины.
Такие противомикробные соединения, как фторхинолоны не только оказывают
неблагоприятное воздействие на организм пациента, но и длительно сохраняются в воде и
почве после выведения из него. Присутствие фторхинолонов во внешней среде
способствует накоплению мультирезистентных бактерий, и, кроме того, они могут
обладать генотоксическим эффектом, поэтому их рассматривают в качестве загрязнителей
окружающей среды (Khadra A. et al., 2012).
Одной из причин увеличения числа штаммов, резистентных ко многим
противомикробным препаратам, считают появление мутаций в генах, кодирующих
мишени данных соединений. В случае фторхинолонов мишенями являются
топоизомеразы второго порядка: гираза и топоизомераза IV. В ходе изучения генов,
которые кодируют данные ферменты, в них были выявлены области, мутации в которых
приводят к развитию устойчивости к этим препаратам. Эти участки были названы
областями, определяющими резистентность к фторхинолонам, или quinolone resistance
determining region (QRDR). В работах, посвящённых исследованию устойчивости M.
hominis к фторхинолонам, координаты QRDR были определены для каждого гена. В гене
gyrA эта область расположена на участке между 346 и 738 нуклеотидами, в гене gyrB -
между 1270 и 1493 нуклеотидами (Bebear C.M. et al., 1997), в гене parC - между 139 и 573
нуклеотидами, в гене parE - между 1207 и 1503 нуклеотидами (Bebear C.M. et al., 1998).
Целью данного исследования является выявление изолятов M. hominis, выделенных
на территории Санкт-Петербурга, являющихся носителями мутаций в генах субъединиц
гиразы и топоизомеразы IV, и оценка их восприимчивости к фторхинолонам. В рамках
поставленной цели решаются следующие задачи:
1. Выявление устойчивых к фторхинолонам штаммов M. hominis, выделенных
в лаборатории иммунохимических технологий НИИ ЭМ им. Пастера.
2. Амплификация и секвенирование геномных последовательностей M.
hominis, мутации в которых ассоциированы с устойчивостью к фторхинолонам.
3. Оценка вклада выявленных мутаций в развитие устойчивости у штаммов с
различными показателями резистентности к фторхинолонам.7
Работа выполнена в лаборатории молекулярно-биологических технологий отдела
новых технологий, НИИ ЭМ им. Пастера.
1. В развитие устойчивости M. hominis к фторхинолонам помимо мутаций генов
gyrA/gyrB и parC/parE вносят вклад иные факторы.
2. У M. hominis наиболее подвержен изменениям участок, отвечающий за
устойчивость к фторхинолонам, в составе гена parC.
3. На территории Санкт-Петербурга распространены устойчивые варианты M.
hominis, которые не несут мутаций в области QRDR.
