Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Амфиподы…
1.2 Амфиподы озера Байкал
1.3 Эволюция амфипод в озере Байкал
1.4 Биология Gmelinoides fasciatus озера Байкал………………………………………………………..6
1.5 Популяции Gmelinoides fasciatus озера Байкал
1.6 Цитогенетика амфипод…
Глава 2. Материал и методы
2.1 Материал
2.2 Метод экстракции ДНК
2.3 Электрофорез ДНК
2.4 Амплификация ДНК фрагмента гена цитохромоксидазы I(COI) и гена 18S
рРНК
2.5 Секвенирование ДНК
2.6 Приготовление цитологических препаратов митотически делящихся клеток………………….22
2.7 Подготовка зондов для флуоресцентной гибридизации in situ (FISH)………………………..…23
2.8 Проведение FISH
2.9 Микроскопия и обработка изображений
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1 Анализ последовательностей фрагмента гена первой субъединицы цитохром-с-оксидазы(CO1) митохондриальной ДНК
3.2 Сравнение последовательности фрагмента гена цитохромоксидазы 1(COI) у амфипод из
инвазивных популяции Ладожского озера и автохтонных популяций озера
Байкал
3.3 Цитогенетический анализ Gmelinoides fasciatus
3.3.1 Ацетоорсеиновое окрашивание
3.3.2 Окрашивание хромосом интеркалирующим красителем DAPI………………………….33
3.3.3 Флуоресцентная гибридизации in situ (FISH) с теломерными повторами (TTAGG)n и
локализация их на хромосомах G. fasciatus
3.3.3 Анализ ядрышковых организаторов(NOR) в кариотипе G. fasciatus методом
флуоресцентной гибридизации in situ (FISH)……………………………………………………………………..35
3.4 Анализ нуклеотидных последовательностей гена 18S рДНК Gmelinoides
fasciatus
Выводы
Список литературы
Благодарности
Байкальская амфипода Gmelinoides fasciatus (Stebbing, 1899) представляет большой
научный интерес в связи с ее широкими адаптационными способностями. В середине
прошлого века этот вид из автохтонной популяции озера Байкал претерпел успешную
акклиматизацию в целом ряде водоемов центральных и северо-западных областей России.
Его направленная интродукция была связана с попыткой расширения кормовой базы
промысловых рыб (Задоенко, 1985; Иоффе, 1968, 1974). Итогом этого явилось то, что в
настоящее время представители этого вида встречаются в целом ряде водоемов
Карельского перешейка, Ладожском и Онежском озерах, а также Финском заливе
Балтийского моря. Занимая одно из первых мест среди беспозвоночных по числу успешных
вселений и последующему широкому распространению в новых условиях среды, амфипода
G. fasciatus может служить модельным объектом для изучения различных механизмов
биологической адаптации. Расселение G. fasciatus под влиянием антропогенных факторов
за пределы своего естественного ареала может коренным образом менять биоразнообразие
в экосистемах (Березина, 2003, 2005). Одним из подходов в раскрытии механизмов,
лежащих в основе процесса адаптации, может служить изучение геномов видов-вселенцев
из автохтонных и инвазивных популяций. С другой стороны, эколого-генетический подход
к изучению динамики расселения вида представляется чрезвычайно важным для выявления
характеристик, определяющих успех инвазии.
Оставаясь одним из наиболее многочисленных представителей эндемичной фауны
пресноводного озера Байкал, G. fasciatus предоставляют уникальную возможность для
выяснения механизмов, лежащий в основе эволюции отдельных видов, в том числе и в
пределах клады амфипод, а также поиске их филогенетических связей. Использование
современных молекулярных методов анализа намного повышает разрешающую
способность традиционных популяционно-генетических подходов.
Амфипода G. fasciatus в последнее время представляет особый интерес в
прикладных исследованиях, связанных с проблемами биоиндикации и биомониторига
состояния окружающей среды. Благодаря особенностям жизненного цикла и являясь
представителем группы гидробионтов этот объект был успешно апробирован в качестве
природного вида-индикатора оценки экологической напряженности водной среды с
использованием цитогенетических показателей (Даев и др., 2014). Проведение такого рода генетического мониторинга намного повышает эффективность экологического
мониторинга среды в целом, поскольку может входить в комплексную оценку наряду с
выявлением нарушений эмбрионального развития у одного и того же вида.3
Наконец, использование цитогенетических и молекулярно-цитогенетических
характеристик генома G. fasciatus позволяет изучать возможные изменения генетического материала на разных уровнях его организации, что может пролить свет как на процесс адаптаций, так на эволюционные преобразования.
В этой связи целью настоящей работы явилась молекулярно-цитогенетическая
характеристика генома Gmelinoides fasciatus. Для достижения поставленной цели были
сформулированы следующие задачи:
1) отработка методики приготовления цитологических препаратов из делящихся
клеток эмбрионов Gmelinoides fasciatus;
2) освоение метода ПЦР и анализ секвенированных последовательностей фрагментов
ДНК;
3) конструирование молекулярных зондов и освоение методики флуоресцентной
гибридизации in situ (FISH).
1) В результате освоение молекулярно-цитогенетических методов дана первичная
характеристика генома Gmelinoides fasciatus:
- кариотип амфиподы представлен 26 парами преимущественно метацентрических
хромосом схожего размера;
- выявлено варьирование числа ядрышковых организаторов от 2 до 10, а также
интенсивности сигнала FISH с зондом 18S рДНК на хромосомах амфиподы;
- локализация сигнала FISH зонда (TTAGG)n продемонстрирована в теломерных
районах на большинстве хромосом, в ряде случаев отмечена интерстециальное
расположение сигнала.
2) Отсутствие вариабельности последовательностей нуклеотидов гена 18S рДНК у
амфипод из популяций Ладожского озера, Финского залива и озера Байкал указывает
на их принадлежность к одному виду - G. fasciatus.
3) Идентичность последовательности нуклеотидов фрагмента митохондриального гена
COI у амфипод Ладожской популяции и юго-восточной части озера Байкал
подтвердила источник происхождения вида-вселенца