Генетические механизмы супрессии мутаций в генах, контролирующих темновой биосинтез хлорофилла у зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii
|
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1 Обзор литературы
1.1 Биосинтез тетрапирролов в фотосинтезирующей клетке
1.2 Биосинтез хлорофилла из протопорфирина IX
1.2.1 Магний-хелатаза
1.2.2 Гены, кодирующие магний-хелатазу
1.2.3 Активность магний-хелатазы
1.2.4 Исследования отдельных субъединиц магний-хелатазы
1.2.5 Структурные исследования и предложенный механизм функционирования
магний-хелатазы 16
1.3 Регуляция биосинтеза хлорофилла
1.3.1 Регуляция синтеза АЛК
1.3.2 Регуляция в точке ветвления синтез гема и хлорофилла
1.3.3 Регуляция биосинтеза хлорофилла цитокининами
1.4 Цитокинины
1.4.1 Биосинтез цитокининов у Arabidopsis thaliana
1.4.2 Микробные продуценты цитокининов
1.4.3 Цитокинины у фотосинтезирующих микроорганизмов
1.4.4 Цитокинины микроводорослей
1.5 Супрессия как метод генетического анализа
1.5.1 Механизмы супрессии
1.5.2 Использование супрессии при изучении биосинтеза хлорофилла
2 Материалы и методы
2.1 Растительный материал
2.2 Условия культивирования
2.3 Изучение потребности штамма R6-brs в дрожжевом экстракте для роста
2.4 Определение размеров клеток
2.5 Измерение скорости деления клеток
2.6 Сортировка клеток по размеру методов цитометрии
2.7 Выделение ДНК
2.8 Выделение РНК
2.9 Получение кДНК
2.10 Анализ экспрессии генов биосинтеза хлорофилла методом ПЦР-РВ
2.12 Анализ экспрессии предположительных генов биосинтеза цитокининов методом
ПЦР-РВ 45
2.13 Гель-электрофорез
2.14 Секвенирование гена CHLH
2.15 Полногеномное секвенирование
3 Результаты
3.1 Изучение морфологических особенностей ревертанта R6-brs
3.2 Анализ экспрессии генов, кодирующих основные ферменты биосинтеза ХЛ и
цитокининов в клетках C. reinhardtii 54
3.3 Поиск супрессорной мутации в геноме ревертанта R6-brs
ОБСУЖДЕНИЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
1 Обзор литературы
1.1 Биосинтез тетрапирролов в фотосинтезирующей клетке
1.2 Биосинтез хлорофилла из протопорфирина IX
1.2.1 Магний-хелатаза
1.2.2 Гены, кодирующие магний-хелатазу
1.2.3 Активность магний-хелатазы
1.2.4 Исследования отдельных субъединиц магний-хелатазы
1.2.5 Структурные исследования и предложенный механизм функционирования
магний-хелатазы 16
1.3 Регуляция биосинтеза хлорофилла
1.3.1 Регуляция синтеза АЛК
1.3.2 Регуляция в точке ветвления синтез гема и хлорофилла
1.3.3 Регуляция биосинтеза хлорофилла цитокининами
1.4 Цитокинины
1.4.1 Биосинтез цитокининов у Arabidopsis thaliana
1.4.2 Микробные продуценты цитокининов
1.4.3 Цитокинины у фотосинтезирующих микроорганизмов
1.4.4 Цитокинины микроводорослей
1.5 Супрессия как метод генетического анализа
1.5.1 Механизмы супрессии
1.5.2 Использование супрессии при изучении биосинтеза хлорофилла
2 Материалы и методы
2.1 Растительный материал
2.2 Условия культивирования
2.3 Изучение потребности штамма R6-brs в дрожжевом экстракте для роста
2.4 Определение размеров клеток
2.5 Измерение скорости деления клеток
2.6 Сортировка клеток по размеру методов цитометрии
2.7 Выделение ДНК
2.8 Выделение РНК
2.9 Получение кДНК
2.10 Анализ экспрессии генов биосинтеза хлорофилла методом ПЦР-РВ
2.12 Анализ экспрессии предположительных генов биосинтеза цитокининов методом
ПЦР-РВ 45
2.13 Гель-электрофорез
2.14 Секвенирование гена CHLH
2.15 Полногеномное секвенирование
3 Результаты
3.1 Изучение морфологических особенностей ревертанта R6-brs
3.2 Анализ экспрессии генов, кодирующих основные ферменты биосинтеза ХЛ и
цитокининов в клетках C. reinhardtii 54
3.3 Поиск супрессорной мутации в геноме ревертанта R6-brs
ОБСУЖДЕНИЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Хлорофиллы (ХЛ) – уникальные природные тетрапирролы, играющие ключевую
роль не только в жизни фотосинтезирующих организмов, но и всей биосфере. Их
биосинтез связан с морфогенезом растительной клетки и реакциями фотосинтеза –
запасанием и передачей энергии света. Важнейшая фундаментальная проблема
современной биологической науки состоит в изучении природы процессов биосинтеза
ХЛ, механизмов его генетической и биохимической регуляции и закономерностей
изменений, которые они претерпели в ходе эволюции при адаптации к различным
источникам и формам освещения. Изучение супрессии мутаций, блокирующих ключевые
этапы биосинтеза ХЛ у Chlamydomonas reinhardtii (C. reinhardtii), открывает возможности
выявления компенсаторных механизмов, обеспечивающих функционирование аппарата
биосинтеза ХЛ при его нарушении, и позволяет оценить адаптивный потенциал
фотосинтезирующей клетки.
Большое внимание уделяется изучению роли цитокининов в регуляции биосинтеза
хлорофилла. Свет и цитокинины оказывают схожее влияние на рост и развитие растений –
они контролируют раскрытие семядолей и развитие листьев, апикальное доминирование,
дифференциацию хлоропласта и др. [Аверина и Яронская, 2012]. Целый ряд
фотосинтетических ядерных генов, экспрессия который регулируется светом, также
отвечает и на действие цитокининов. При этом о роли и метаболизме цитокининов у
одноклеточных водорослей известно очень мало.
Объект исследования – зеленая одноклеточная водоросль хламидомонада
C. reinhardtii. Этот микроорганизм, интенсивно используемый в экспериментальных
исследованиях генетического контроля процессов фотосинтеза, является модельным
биологическим объектом, совмещающим в себе особенности генетических систем про- и
эукариот [Harris, 1989; Rochaix, 1995]. C. reinhardtii относят к зелёным водорослям
(Chlorophyta), порядка Chlamydomonadales (так известный как Volvoxcales), семейства
Chlamydomonadaceae. Она способна к трём типам питания: фототрофному,
миксотрофному и гетеротрофному. В отличие от высших растений, формирование
фотосинтетических мембран хлоропласта и синтез хлорофилла в клетках хламидомонады
происходит не только на свету, но и в темноте, – за счёт утилизации источников углерода
из питательной среды. Успешное использование C. reinhardtii в качестве модельного
объекта генетических исследований обусловлено такими особенностями ее биологии, как6
наличие полового размножения, короткий гаплофазный жизненный цикл и простота культивирования.
Целью работы стало изучение ревертанта R6-brs, у которого восстановление
биосинтеза хлорофилла на фоне мутации бесхлорофильности brs-1 в гене CHLH,
кодирующем большую субъединицу магний-хелатазы, произошло в результате
доминантной супрессорной мутации, тесно сцепленной с мутацией brs-1.
Для реализации поставленной цели было необходимо выполнить следующие задачи:
1. Освоение навыков работы с культурами клеток водоросли Chlamydomonas
reinhardtii, приготовления сред и методов культивирования.
2. Освоение молекулярно-биологических методов работы с водорослями.
3. Изучение морфологических особенностей ревертанта R6-brs.
4. Анализ экспрессии генов, кодирующих основные ферменты биосинтеза ХЛ и
цитокининов в клетках C. reinhardtii дикого типа и ревертанта в различных
условиях культивирования.
5. Поиск супрессорной мутации в геноме ревертанта R6-brs.
роль не только в жизни фотосинтезирующих организмов, но и всей биосфере. Их
биосинтез связан с морфогенезом растительной клетки и реакциями фотосинтеза –
запасанием и передачей энергии света. Важнейшая фундаментальная проблема
современной биологической науки состоит в изучении природы процессов биосинтеза
ХЛ, механизмов его генетической и биохимической регуляции и закономерностей
изменений, которые они претерпели в ходе эволюции при адаптации к различным
источникам и формам освещения. Изучение супрессии мутаций, блокирующих ключевые
этапы биосинтеза ХЛ у Chlamydomonas reinhardtii (C. reinhardtii), открывает возможности
выявления компенсаторных механизмов, обеспечивающих функционирование аппарата
биосинтеза ХЛ при его нарушении, и позволяет оценить адаптивный потенциал
фотосинтезирующей клетки.
Большое внимание уделяется изучению роли цитокининов в регуляции биосинтеза
хлорофилла. Свет и цитокинины оказывают схожее влияние на рост и развитие растений –
они контролируют раскрытие семядолей и развитие листьев, апикальное доминирование,
дифференциацию хлоропласта и др. [Аверина и Яронская, 2012]. Целый ряд
фотосинтетических ядерных генов, экспрессия который регулируется светом, также
отвечает и на действие цитокининов. При этом о роли и метаболизме цитокининов у
одноклеточных водорослей известно очень мало.
Объект исследования – зеленая одноклеточная водоросль хламидомонада
C. reinhardtii. Этот микроорганизм, интенсивно используемый в экспериментальных
исследованиях генетического контроля процессов фотосинтеза, является модельным
биологическим объектом, совмещающим в себе особенности генетических систем про- и
эукариот [Harris, 1989; Rochaix, 1995]. C. reinhardtii относят к зелёным водорослям
(Chlorophyta), порядка Chlamydomonadales (так известный как Volvoxcales), семейства
Chlamydomonadaceae. Она способна к трём типам питания: фототрофному,
миксотрофному и гетеротрофному. В отличие от высших растений, формирование
фотосинтетических мембран хлоропласта и синтез хлорофилла в клетках хламидомонады
происходит не только на свету, но и в темноте, – за счёт утилизации источников углерода
из питательной среды. Успешное использование C. reinhardtii в качестве модельного
объекта генетических исследований обусловлено такими особенностями ее биологии, как6
наличие полового размножения, короткий гаплофазный жизненный цикл и простота культивирования.
Целью работы стало изучение ревертанта R6-brs, у которого восстановление
биосинтеза хлорофилла на фоне мутации бесхлорофильности brs-1 в гене CHLH,
кодирующем большую субъединицу магний-хелатазы, произошло в результате
доминантной супрессорной мутации, тесно сцепленной с мутацией brs-1.
Для реализации поставленной цели было необходимо выполнить следующие задачи:
1. Освоение навыков работы с культурами клеток водоросли Chlamydomonas
reinhardtii, приготовления сред и методов культивирования.
2. Освоение молекулярно-биологических методов работы с водорослями.
3. Изучение морфологических особенностей ревертанта R6-brs.
4. Анализ экспрессии генов, кодирующих основные ферменты биосинтеза ХЛ и
цитокининов в клетках C. reinhardtii дикого типа и ревертанта в различных
условиях культивирования.
5. Поиск супрессорной мутации в геноме ревертанта R6-brs.
Генетическую детерминацию механизмов биосинтеза хлорофиллов и его регуляции
светом у модельного объекта генетики фотосинтеза – водоросли C. reinhardtii изучали на
модели мутантов по гену CHLH, кодирующему большую (H) субъединицу ключевого
фермента биосинтеза хлорофилла, магний-хелатазы. Предмет исследований – зеленый в
темноте и на свету ревертант R6-brs, полученный в результате УФ-мутагенеза клеток
оранжевого светочувствительного мутанта brs-1 по гену CHLH. У ревертанта R6-brs
восстановление биосинтеза хлорофилла на фоне мутации бесхлорофильности brs-1 в гене
CHLH, произошло в результате ядерной доминантной супрессорной мутации.
В ходе работы были изучены морфологические особенности штамма R6-brs.
Установлено, что клетки ревертанта формируют мелкие колонии. Для нормального роста
клеток ревертанта в питательную среду необходимо добавлять дрожжевой экстракт.
Объемы клеток ревертанта почти в 4.5 раза превышает таковой у дикого типа и время их
удвоения втрое больше показателей штамма дикого типа 137С. Методом проточной
цитометрии подтверждено, что клетки ревертанта не являются диплоидами. По-видимому,
крупный размер клеток R6-brs обусловлен продолжительным временем их роста без деления.
При изучении штамма ревертанта R6-brs был проведен анализ экспрессии генов
биосинтеза хлорофилла, который показал, что в условиях темноты транскрипция многих
исследованных нами генов идет скоординировано на одном уровне. При световой
индукции в клетках ревертанта наблюдалось многократное увеличение экспрессии генов
HEMA и CHLI2. В условиях постоянного освещения экспрессия генов GTS и HEMA у
штамма R6-brs соответствовала уровню дикого типа. Транскрипция гена CHLH была в
несколько раз выше, чем у дикого типа. У остальных исследованных генов биосинтеза
хлорофилла экспрессия на свету подавлена.
В работе были идентифицированы последовательности в геноме C. reinhardtii,
кодирующие ферменты, предположительно участвующие в синтезе цитокининов. На
основании этих последовательностей были созданы праймеры, с помощью которых
провели анализ экспрессии этих генов. Установлено, что транскрипция генов TRI1 и APT
усиливается светом. Экспрессия гена ADK у ревертанта максимальна в темноте и
ослабевает на свету. В условиях постоянного освещения в клетках R6-brs все три гены
экспрессируются слабее, чем у дикого типа.
Причиной фенотипических особенностей ревертанта может быть избыточное
содержание в его клетках эндогенных цитокининов. Анализ экспрессии генов биосинтеза63
цитокининов показал, что на свету в клетках ревертанта их экспрессии снижена, повидимому, за счет ингибирования эндогенными цитокининами.
Таким образом, в результате супрессорной мутации у ревертанта R6-brs был
восстановлен биосинтез хлорофилла, при этом нарушилась сложная регуляция
многоступенчатого синтеза тетрапирролов, что привело к серьезным изменениям на
фенотипическом уровне, затрагивающим процессы деления клеток
светом у модельного объекта генетики фотосинтеза – водоросли C. reinhardtii изучали на
модели мутантов по гену CHLH, кодирующему большую (H) субъединицу ключевого
фермента биосинтеза хлорофилла, магний-хелатазы. Предмет исследований – зеленый в
темноте и на свету ревертант R6-brs, полученный в результате УФ-мутагенеза клеток
оранжевого светочувствительного мутанта brs-1 по гену CHLH. У ревертанта R6-brs
восстановление биосинтеза хлорофилла на фоне мутации бесхлорофильности brs-1 в гене
CHLH, произошло в результате ядерной доминантной супрессорной мутации.
В ходе работы были изучены морфологические особенности штамма R6-brs.
Установлено, что клетки ревертанта формируют мелкие колонии. Для нормального роста
клеток ревертанта в питательную среду необходимо добавлять дрожжевой экстракт.
Объемы клеток ревертанта почти в 4.5 раза превышает таковой у дикого типа и время их
удвоения втрое больше показателей штамма дикого типа 137С. Методом проточной
цитометрии подтверждено, что клетки ревертанта не являются диплоидами. По-видимому,
крупный размер клеток R6-brs обусловлен продолжительным временем их роста без деления.
При изучении штамма ревертанта R6-brs был проведен анализ экспрессии генов
биосинтеза хлорофилла, который показал, что в условиях темноты транскрипция многих
исследованных нами генов идет скоординировано на одном уровне. При световой
индукции в клетках ревертанта наблюдалось многократное увеличение экспрессии генов
HEMA и CHLI2. В условиях постоянного освещения экспрессия генов GTS и HEMA у
штамма R6-brs соответствовала уровню дикого типа. Транскрипция гена CHLH была в
несколько раз выше, чем у дикого типа. У остальных исследованных генов биосинтеза
хлорофилла экспрессия на свету подавлена.
В работе были идентифицированы последовательности в геноме C. reinhardtii,
кодирующие ферменты, предположительно участвующие в синтезе цитокининов. На
основании этих последовательностей были созданы праймеры, с помощью которых
провели анализ экспрессии этих генов. Установлено, что транскрипция генов TRI1 и APT
усиливается светом. Экспрессия гена ADK у ревертанта максимальна в темноте и
ослабевает на свету. В условиях постоянного освещения в клетках R6-brs все три гены
экспрессируются слабее, чем у дикого типа.
Причиной фенотипических особенностей ревертанта может быть избыточное
содержание в его клетках эндогенных цитокининов. Анализ экспрессии генов биосинтеза63
цитокининов показал, что на свету в клетках ревертанта их экспрессии снижена, повидимому, за счет ингибирования эндогенными цитокининами.
Таким образом, в результате супрессорной мутации у ревертанта R6-brs был
восстановлен биосинтез хлорофилла, при этом нарушилась сложная регуляция
многоступенчатого синтеза тетрапирролов, что привело к серьезным изменениям на
фенотипическом уровне, затрагивающим процессы деления клеток



