ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СИМВОЛОВ 3
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
Понятие о микробиоте и её состав 8
Изменения кишечной микробиоты при ожирении 10
Изменения кишечной микробиоты при сахарном диабете 2 типа 15
Изменения кишечной микробиоты при метаболическом синдроме 17
Основные лечебные подходы к составу микробиоты 22
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 25
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 31
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 54
ВЫВОДЫ 60
ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕКОМЕНДАЦИЯ 62
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 63
ПРИЛОЖЕНИЯ 72
Метаболические заболевания являются глобальной проблемой последнего столетия во всем мире. Так, распространенность ожирения в некоторых развитых странах достигает характера пандемии, а для сахарного диабета 2 типа (СД) отмечается ежегодный прогрессирующий рост заболеваемости.
Что касается метаболического синдрома (МС), то по оценкам, он распространен, по крайней мере, у четверти взрослого населения в мире и с каждым годом становится серьезной проблемой общественного здравоохранения, особенно в городских районах. Помимо генетической предрасположенности, существуют различные современные факторы внешней среды, такие как гиподинамия, диета, гигиена, которые благоприятствуют развитию метаболических нарушений [1].
За последние годы было проведено множество молекулярно-генетических исследований, результаты которых указывают на непосредственную связь между качественными и количественными изменениями в составе микробиоты кишечника и развитием ожирения, а также сопутствующих ему заболеваний, в первую очередь сахарного диабета 2 типа [2].
Микробиота кишечника, обладающая обширным и уникальным геномом, глубоко влияет на метаболизм человека. Во-первых, она помогает функционировать метаболическим путям организма человека через синтез необходимых витаминов (особенно группы В); во-вторых, бактерии толстой кишки, через ферментацию неперевариваемых углеводов, содержащихся в рационе питания, обеспечивают организм человека такими соединениями, как короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК), которые либо являются источником энергии для организма человека, либо сигнализируют через мембранные рецепторы для интеграции метаболических функций [3].
Считается, что диеты европейского стиля, богатые насыщенными жирами, простыми углеводами и лишенные пищевых волокон, изменяют структуру микробиоты кишечника, что приводит к неблагоприятному влиянию на проницаемость кишечника и его колонизацию кишечными бактериями, вызывающими нарушение обмена веществ. Одним из таких негативных метаболических изменений является дисфункция инсулинового пути, которая в свою очередь, приводит к гиперинсулинемии и стимулирует выработку фактора некроза опухоли – α (ФНО-α) в жировой ткани. Это приводит к усилению липолиза и увеличению свободных жирных кислот (СЖК) и глицерина. Высокий уровень СЖК способен индуцировать дисфункцию β-клеток поджелудочной железы, что в будущем приводит к развитию гипергликемии, окислительному стрессу и инсулинорезистентности [3,4].
Кроме того, целый ряд экспериментальных данных свидетельствует о том, что грамотрицательные бактерии толстой кишки играют определенную роль в возникновении метаболических заболеваний отчасти из-за высвобождения липополисахарида (ЛПС), который вызывает развитие метаболической эндотоксемии и активирует хроническую воспалительную реакцию, приводящую к инсулинорезистентности [5,6].
Наряду с новыми работами [1-3, 35-37], предоставляющими доказательства связи кишечной микробиоты и метаболических нарушений, появляется все больше исследований, стремящихся использовать эти факты в терапевтических целях. Основными терапевтическими стратегиями в этой области являются изменение диеты (увеличение доли клетчатки), использование пребиотиков, пробиотиков, антибиотиков, поиск новых соединений с прицельным механизмом действия, использование трансплантации фекальной микробиоты. Результаты исследований, однако, зачастую противоречивы, и необходимы мультицентровые крупные исследования с использованием унифицированных протоколов и одинаковых по составу пре-/пробиотиков [7].
Цель исследования: клиническая оценка состава кишечной микробиоты у пациентов с метаболическими нарушениями для формирования новых терапевтических стратегий, направленных на снижение и предупреждение развития и прогрессирования метаболических заболеваний.
Задачи исследования:
1. Определить распространённость метаболических нарушений в зависимости от состава кишечной микробиоты.
2. Изучить особенности метаболического профиля обследуемых пациентов.
3. Провести сравнительную оценку влияния пола, возраста и ИМТ на возникновение метаболических нарушений и состав кишечной микробиоты.
4. Исследовать качественное и количественное соотношение бактерий толстой кишки у пациентов с метаболическими нарушениями с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и метода метагеномного исследования с анализом последовательностей генов 16S рРНК.
5. Оценить уровень С-реактивного белка, как маркера воспаления, у обследуемых пациентов и уточнить его связь с нарушением состава кишечной микробиоты.
Практическая значимость результатов данного исследования реализуется в необходимости разработки эффективных лечебных мероприятий для реальной клинической практики с целью контроля метаболических заболеваний и снижения риска развития сахарного диабета, ожирения и, в целом, метаболического синдрома в ближайшем будущем.
Область применения: терапия, гастроэнтерология, эндокринология, кардиология.
Цель данного исследования заключалась в клинической оценке состава микробиоты кишечника у пациентов с метаболическими нарушениями для возможного дальнейшего применения полученных знаний в области профилактики и лечения метаболических заболеваний.
Был собран и проанализирован материал от 56 пациентов, разделенных на 2 группы: первую (основную) группу (n=38) составили пациенты с избыточной массой тела и ожирением (ИМТ > 25,0) и метаболическими нарушениями (средний возраст пациентов – 58,29±1,53 лет). Вторую (контрольную) группу (n=18) составили пациенты с нормальной массой тела (18,5< ИМТ <25,0) и без метаболических нарушений (средний возраст пациентов составил 54,94±1,78 лет). Группы были сопоставимы по возрасту и полу.
Критериями исключения пациентов из исследования было наличие онкопатологии, тиретоксикоза или гипотиреоза, хронической болезни почек 3b стадии и более, беременности и лактации, инфекционных заболеваний, заболеваний, требующих приема глюкокортикостероидов, а также прием антибактериальных препаратов, пробиотиков за 30 дней до сбора материала.
Для оценки метаболических и микробиотических нарушений пациенты были обследованы: выполнялся биохимический анализ крови (глюкоза, общий холестерин, триглицериды, ЛПВП, ЛПНП, C-реактивный белок), проводилась антропометрия с расчетом индекса массы тела, оценивался уровень артериального давления. Всем пациентам выполнялось исследование микробиоценоза толстого кишечника с помощью ПЦР-РВ кала. Десяти пациентам из основной группы (1 группа) было проведено исследование микробиоты толстого кишечника методом метагеномного исследования с анализом последовательностей генов 16S рРНК.
В ходе исследования были оценены особенности метаболического профиля у пациентов с повышенным ИМТ: обнаружена разница между уровнем ЛПВП при разных значениях ИМТ. При избыточной массе тела и ожирении I степени уровень ЛПВП достоверно выше, чем при наличии ожирения II или III степени (p <0,05). Данная связь ИМТ и ЛПВП подтвердилась и при проведении корреляционного анализа Спирмена, позволившего получить слабую отрицательную корреляционную связь между величиной ИМТ и уровнем ЛПВП. Аналогичная корреляция получена между уровнями ЛПВП и общего холестерина. Кроме того, получена положительная корреляционная связь средней силы (r= 0,673, p<0,05) между величиной ИМТ и уровнем глюкозы крови (рис. 1).
Полученные при корреляционном анализе Спирмена положительные связи средней силы между уровнем ТГ и глюкозы, глюкозы и ИМТ, ЛПВП и СРБ, СРБ и ТГ подтверждают доказанную взаимосвязь обмена холестерина с уровнем гликемии и системным воспалением [64].
При анализе связи биохимических показателей метаболического синдрома с бактериями толстой кишки в основной группе обратили на себя внимание род Enterococcus spp. и соотношение родов Enterobacter spp. / Citrobacter spp. С данными показателями микробиоты выявлены корреляции (r = 0,3-0,5) с рядом cоставляющих биохимического профиля пациентов. Слабая отрицательная связь получена между количеством Enterococcus spp и уровнем триглицеридов и ЛПВП, а также между значением Enterobacter spp. / Citrobacter spp и уровнем ХС. Положительная же корреляция наблюдалась между уровнями триглицеридов, ЛПВП, СРБ и значением Enterobacter spp. / Citrobacter spp. (рис. 2).
При сравнении состава кишечной микробиоты у пациентов двух основных групп достоверно чаще в группе контроля обнаруживается большее значение общей бактериальной массы, большее количество Bifidobacterium spp., Bacteroides fragilis group и Faecalibacterium prausnitzii, нежели в группе метаболических нарушений, что соответствует уже существующим представлениям о связи бактериального состава кишечника с массой тела и системными метаболическими нарушениями [65, 66, 67, 68, 69, 70]. Именно увеличение количества вышеназванных бактерий в контрольной группе, а не их меньшее значение в группе пациентов с метаболическими нарушениями можно объяснить большей бактериальной массой именно в группе контроля. Следует отметить, что эти различия в составе микробиоты наблюдались между пациентами с нормальной массой тела и пациентами с избыточной массой тела/ожирением I степени, а при сравнении с пациентами, страдающими ожирением II-III степени, достоверных различий не выявлено. Полученные данные об изменении бактериального состава микробиоты кишечника при метаболическом синдроме наводят на мысль о ее значимой роли в развитии метаболических нарушений на этапе набора веса при ИМТ< 35.
Проведение корреляционного анализа по критерию Спирмена между ИМТ и количеством бактерий толстой кишки подтвердило отрицательную связь между ИМТ и количеством общей бактериальной массы, Bacteroides fragilis group и Faecalibacterium prausnitzii, однако, корреляция не сильна (r = - 0,3). Но имеющие место положительные корреляционные связи между общей бактериальной массой, Bacteroides fragilis group и Faecalibacterium prausnitzii высокой силы (r = 0,7-0,8), а также между общей бактериальной массой и Bifidobacterium spp средней силы (r = 0,6) все-таки указывают на взаимную связь данных показателей кишечной микробиоты и их положительное влияние на метаболические процессы и избыток массы тела.
Помимо вышеописанных бактерий обращает на себя внимание Parvimonas micra, повышенное количество которой чаще встречается у лиц с ожирением I степени в сравнении с пациентами с нормальной массой тела. Эти данные подтверждаются положительной корреляционной связью средней силы (r= 0,516, p<0,01) между величиной ИМТ и количеством Parvimonas micra (рис. 3). Также получена положительная корреляция средней силы (r= 0,408, p<0,05) с уровнем глюкозы, что тоже подтверждает связь Parvimonas micra с метаболическими нарушениями (рис. 4).
Bacteroides thetaiotaomicron также имеет слабую положительную корреляционную связь с биохимическими показателями (ТГ, СРБ) и достоверно в меньшем количестве наблюдается у пациентов с избыточной массой тела, нежели у пациентов с ожирением I степени.
В работе проведена сравнительная оценка влияния пола на состав микробиоты кишечника. Сравнивались группы, состоявшие из 27 женщин и 29 мужчин. Среди женщин достоверно чаще встречается большее общее количество бактерий, повышенное количество Bacteroides fragilis group и Faecalibacterium prausnitzii. Учитывая имеющиеся в настоящей работе данные о связи вышеназванных бактерий с метаболическими нарушениями, а именно, их меньшее количество при наличии тех или иных компонентов метаболического синдрома, можно сделать вывод, что женщины в данном исследовании были менее подвержены обменным нарушениям, нежели мужчины. При проведении корреляционного анализа по критерию Спирмена в основной и контрольной группах у женщин выявлена отрицательная корреляционная связь средней силы между ИМТ и общей бактериальной массы (r= -0,430, p<0,01), а также количеством Faecalibacterium prausnitzii (r= -0,502, p<0,01). Среди женщин с ожирением I степени связь ИМТ и общей бактериальной массы не вызывает сомнений, учитывая коэффициент корреляции равный -1 (рис. 6).
Также в подтверждение известным данным о связи Candida spp с метаболическими нарушениями [71] получена положительная корреляционная связь (r= 0,395, p<0,05) между величиной ИМТ и количеством Candida spp.
В свою очередь у мужчин выявлена отрицательная корреляционная связь средней силы (r= -0,425, p<0,05) между величиной ИМТ и количеством Bacteroides fragilis group (рис. 8), что в совокупности с вышеописанными данными наводит на мысль о роли в развитии метаболических нарушений как женщин, так и мужчин, таких вышеупоминавшихся бактерий, как Faecalibacterium prausnitzii, Bacteroides fragilis. Данные выводы подтверждаются сильной отрицательной корреляцией (r= -0,878, p<0,01) между величиной ИМТ и соотношением Bacteroides fragilis group/Faecalibacterium prausnitzii среди мужчин с избыточной массой тела (рис. 9), а также связью между ИМТ и количеством Bacteroides fragilis group с коэффициентом корреляции равном -1 среди женщин с ожирением I степени (рис. 7).
Кроме того, среди мужчин с ожирением II и III степени выявлена полная взаимосвязь (r= 1,000, p<0,01) между величиной ИМТ и количеством E.coli (рис. 10).
Интересный факт был установлен насчет влияния возраста на состав кишечной микробиоты и возникновение метаболических нарушений. Так, в основной группе определялась отрицательная корреляционная связь средней силы (r= -0,561, p<0,01) между возрастом и уровнем ЛПВП. Кроме того, в той же группе пациентов была замечена положительная корреляционная связь средней силы (r= 0,438, p<0,01) между возрастом и количеством Enterococcus spp. (рис. 5).
В ходе метагеномного исследования с анализом последовательностей генов 16S рРНК были рассмотрены особенности кишечной микробиоты у пациентов основной группы (1 группа) с сахарным диабетом 2 типа и метаболическим синдромом по сравнению со здоровыми пациентами. На уровне филумов образцы микробиоты пациентов с диабетом существенно различались по составу. Так, у пациентов с сахарным диабетом и метаболическим синдромом по сравнению со здоровыми пациентами была снижена доля Tenericutes. А у пациентов с метаболическим синдромом по сравнению с двумя другими группами в среднем была повышена доля Actinobacteria (рис. 11) [72].
На уровне рода у пациентов с сахарным диабетом была повышена доля Achromobacter и снижена доля Dialister. У группы с метаболическим синдромом относительно двух других групп была повышена доля Lachnospira (рис. 12) [72, 73].
Альфа-разнообразие в группе сахарного диабета обладало самым значительным разбросом и в среднем было несколько ниже, чем в группах здоровых добровольцев и пациентов с метаболическим синдромом (рис. 14).
Для дальнейшего исследования особенностей микробиоты у пациентов с сахарным диабетом и метаболическим синдромом потребуется увеличить число образцов.
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
