Содержание
Список сокращений
1. Введение
2. Обзор литературы
2.1 Рак как заболевание…
2.2 Рак молочной железы…
2.2.1. Классификация типов рака молочной железы………………………………………8
2.3. Негенетические аспекты развития рака молочной железы…………………………….9
2.4. Генетические аспекты развития рака молочной железы………………………..…….11
2.4.1. Наследственная форма рака молочной железы……………………………...…….12
2.4.1.1.Гены с высоким уровнем пенетрантности……………………………………...12
2.4.1.2. Гены с умеренным уровнем пенетрантности…………………………...……...14
2.4.1.3. Изменения с низким уровнем пенетрантности…………………………...……15
2.4.2. Спорадическая форма рака молочной железы……………………………………..15
2.5. Эпигенетические изменения при раке молочной железы……………………………..16
2.6. Структура и функции белка BASP1…………………………………………………….18
3. Материалы и методы
3.1 Банк крови
3.2. Выделение ДНК из замороженной крови………………………………………………23
3.2.1. Выделение ДНК коммерческим набором…………………………………………..23
3.2.2. Метод выделение ДНК с использованием SDS и высаливания белков ………....23
3.2.3. Выделение ДНК с помощью СТАВ и хлороформа ……………………...………..24
3.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)…………………………………………………..25
3.4. Очистка ДНК
3.4.1. Очистка ДНК с помощью твердофазной экстракции на колонках…...…………..27
3.4.2. Очистка ДНК методом прямого осаждения…………………………….………….27
3.5. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле………………………….…28
3.6. Электрофоретическое разделение ДНК в ПААГ…………………………………..…..28
3.7. Окраска полиакриламидного геля нитратом серебра……………………………...….29
3.8. Секвенирование по Сенджеру……………………………………………..……………29
4. Результаты и обсуждения
4.1. Анализ последовательности гена BASP1 и подбор праймеров………………………31
4.2. Анализ BASP1 по базам данных мутаций и генетических вариантов……………….36
4.3. Оптимизация выделения ДНК из замороженной крови………………………………37
4.4. Оптимизация полимеразной цепной реакции (ПЦР)……………………………….…42
4.5. Исследование влияния различных условий на качество секвенирования
5. Выводы
6. Список литературы
Во всем мире рак молочной железы является наиболее распространенной формой рака, поражающей женщин. Особенностью данного типа рака является относительно высокий процент наследственных случаев заболевания (10% от всех случаев). Начало развития рака связано с изменениями в структуре ДНК клетки, чаще всего эти изменения затрагивают гены, являющиеся протоонкогенами, генами-супрессорами опухолей или генами репарации ДНК. Для наследственной формы рака молочной железы уже были обнаружены мутации в генах, которые обуславливают высокий или средний риск развития заболевания, а также однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), определяющие низкую предрасположенность к наследственному раку молочной железы. Однако, несмотря на значительные успехи в области изучения канцерогенеза, в 50% случаев наследственного заболевания причины начала развития рака не были обнаружены, поэтому до сегодняшнего дня активно ведутся поиски генов-кандидатов, нарушения в работе которых могут быть связаны с началом развития наследственного рака молочной железы.
BASP1 – ген, продукт которого играет важную роль в нейрогенезе и поддержании пластичности нервной системы. Кроме того, белок BASP1 обнаруживается в ооцитах, сперматозоидах и ранних эмбрионах позвоночных, участвует в поддержании плюрипотентного состояния клеток, а также участвует в регуляции клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза. В последние годы появляется информация о связи BASP1 с канцерогенезом. Так было показано, что BASP1 может выступать в качестве супрессора для онкогенного транскрипционного фактораMycи косупрессора для онкогенного транскрипционного фактораWT1. Также эктопическая экспрессия BASP1 снижает скорость миграции и пролиферации клеток при развитии лейкозов, опухолей щитовидной и поджелудочной желёз. Более того, при развитии разных форм рака наблюдается нарушенная экспрессия гена BASP1, что способствует прогрессированию заболевания. Наконец, при раке молочной железы BASP1 выполняет роль супрессора ERα (рецептора эстрогена α), нарушения в котором часто наблюдаются при развитии заболевания, а повышенная экспрессия BASP1 коррелирует с более благоприятным прогнозом для пациентов и усиливает противоопухолевый эффект тамоксифена.
Эти данные позволяют рассматривать ген BASP1 в качестве гена-кандидата, нарушения в котором могут способствовать развитию наследственной формы рака молочной железы. Однако структура BASP1 имеет специфические особенности, которые требуют подбора специальных условий для последующей работы с геном BASP1.
Цель исследования: Проанализировать структуру гена BASP1 и подобрать условия работы с ним для последующего исследования его роли в наследственном раке молочной железы.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
1. Создать банк геномной ДНК пациентов с раком молочной железы;
2. Провести анализ информации о гене BASP1 (экзонная организация и промоторы), представленной в геномных базах данных;
3. Подобрать праймеры для амплификации функционально-значимых участков гена BASP1 человека;
4. Подобрать условия амплификации с помощью ПЦР выбранных участков гена BASP1;
5. Исследовать влияние различных условий (температуры, энхансеров, количества ДНК, способов очистки ДНК) на качество секвенирования амплифицированных участков гена BASP1.
1. При анализе роли изменчивости гена BASP1 в генетических заболеваниях необходимо учитывать наличие у этого гена трех промоторов, располагающихся перед экзонами 1а, 1b и 2 внутри CpG-островков.
2. Для амплификации экзонов гена BASP1 в качестве энхансера можно использовать бетаин в конечной концентрации 1М.
3. Полученные результаты свидетельствуют о том, что для секвенирования экзонов гена BASP1 следует применить специализированный подход, используемый для матриц с очень высоким содержанием GC-пар.
