Старение стволовых клеток человека в контексте mTOR-сигналинга

ОГЛАВЛЕНИЕ ............................................................................................................................................ 2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ......................................................................................................................... 5
ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................................................. 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................................................................... 9
1. Основные понятия о стволовых клетках ........................................................................................... 9
1.1. История открытия стволовых клеток ......................................................................................... 9
1.2. Свойства и классификация стволовых клеток........................................................................... 9
1.3. Мезенхимные стволовые клетки...............................................................................................10
1.4. Мезенхимные стволовые клетки человека, выделенные из десквамированного эндометрия
.............................................................................................................................................................11
2. Клеточное старение...........................................................................................................................13
2.1. История развития представлений о феномене старения клеток ............................................13
2.2. Типы клеточного старения и его признаки ..............................................................................14
2.3. Клеточное старение МСК ..........................................................................................................15
2.4. Механизмы, лежащие в основе стресс-индуцированного клеточного старения .................15
3. Белок mTOR и его регуляция ...........................................................................................................17
3.1. История открытия mTOR ..........................................................................................................17
3.2. Доменная структура белка mTOR ............................................................................................18
3.3. Комплексы киназы mTOR .........................................................................................................19
3.4. Регуляция mTOR сигналинга ....................................................................................................21
4. Функциональная роль mTOR в клетке ............................................................................................24
4.1. Контроль над синтезом белка в клетке комплексом mTORС1 ..............................................25
4.2. Регуляция аутофагии комплексом mTORC1 ...........................................................................26
4.3. Роль mTOR в старении ..............................................................................................................27
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .....................................................................................................................30
1. Клеточная линия и особенности культивирования клеток ...........................................................30
2. Моделирование окислительного стресса и условия обработки клеток .......................................30
3. Оценка жизнеспособности клеток методом МТТ ..........................................................................30
4. Электрофорез и иммуноблотинг ......................................................................................................31
4.1. Приготовление проб для электрофоретического разделения ................................................31
4.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле ....................................................................31
4.3. Иммуноблотинг со специфическими антителами...................................................................31
5. Метод проточной цитофлуориметрии.............................................................................................32
5.1. Анализ изменения размера и количества клеток ....................................................................32
5.2. Измерение уровня внутриклеточных АФК..............................................................................33
6. Выявление активности SA-β-Gal .....................................................................................................33
7. Использованные реактивы и ингибиторы .......................................................................................33
8. Статистическая обработка данных ..................................................................................................33
РЕЗУЛЬТАТЫ ...........................................................................................................................................34
1. Выявление роли mTORC1 в H2O2-индуцированном старении эМСК..........................................34
1.1. Выявление эффектов рапамицина на жиснеспособность клеток и на активность
компонентов mTORC1 сигнального пути в Н2О2-обработанных эМСК .....................................34
1.2. Оценка влияния ингибирования mTORС1 на пролиферативный статус стареющих эМСК
и активность р53/р21/Rb сигнального пути ....................................................................................35
1.3. Исследование эффектов рапамицина на фенотип старения клеток и уровень
внутриклеточных АФК в Н2О2-обработанных эМСК....................................................................36
2. Влияние mTOR на Raf/MEK/ERK/p90RSK сигнальный путь в стареющих эМСК ....................38
3. Влияние AKT киназы на mTORС1 сигнальный путь и ее роль в преждевременном старении
эМСК ......................................................................................................................................................39
3.1. Установление роли AKT киназы в регуляции mTORC1 пути при преждевременном
старении эМСК..................................................................................................................................40
3.2. Исследование характера изменения основных признаков старения Н2О2-обработанных
эМСК в условиях ингибирования AKT...........................................................................................40
3.3. Анализ пролиферативного статуса клеток и активности р53/р21/Rb сигнального пути в
Н2О2-обработанных эМСК при действии LY .................................................................................41
4. Роль белка ERK1/2 в регуляции mTORC1 сигнального пути при стресс-индуцированном
старении эМСК......................................................................................................................................42
4.1. Выявление эффектов U0126 на активность mTORС1 сигнального пути в Н2О2-
обработанных клетках ......................................................................................................................42
4.2. Оценка маркеров преждевременного старения клеток в условиях ингибирования
активности ERК1/2............................................................................................................................43
5. Изучение роли AMPK в регуляции mTORC1 пути в процессе Н2О 2-индуцированного старения
эМСК ......................................................................................................................................................45
ОБСУЖДЕНИЕ .........................................................................................................................................48
ВЫВОДЫ ...................................................................................................................................................56
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................................................57
БЛАГОДАРНОСТИ ..................................................................................................................................73
Купить

Эндометриальные мезенхимные стволовые клетки (эМСК) впервые были
обнаружены в десквамированном эндометрии, содержащемся в менструальной крови, в
2007 году (Meng et al., 2007). Показано, что эМСК обладают рядом существенных
преимуществ по сравнению с мезенхимными стволовыми клетками (МСК), полученными
из других источников, важнейшими из которых являются сохранение стабильного
кариотипа и высокой пролиферативной активности при длительном культивировании,
способность дифференцироваться в 9 типов клеток трех зародышевых листков, а также не
инвазивный и не травматичный для пациента способ их изоляции. Эти особенности
делают эМСК привлекательным объектом для использования в заместительной клеточной
терапии, и в настоящее время уже есть сообщения о положительных результатах
трансплантации эМСК людям, страдающим такими заболеваниями, как рассеянный
склероз, мышечная дистрофия Дюшена и сердечная недостаточность (Zhong et al., 2009;
Ichim et al., 2010; Bockeria et al., 2013; Ulrich et al., 2013). Известно, что развитие многих
заболеваний, для которых описано успешное применение эМСК, сопровождается
локальным окислительным стрессом (Agarwal et al., 2005; Di Filippo et al., 2006; Tsutsui et
al., 2011; Terrill et al., 2013), следовательно, после трансплантации эМСК могут оказаться в
неблагоприятном микроокружении. В связи с этим изучение ответов эМСК на
окислительный стресс может моделировать реальные ситуации, возникающие в процессе
трансплантации этих клеток при лечении различных заболеваний. Наряду с такими
широко распространенными реакциями МСК на стрессовые воздействия, как временная
остановка клеточного цикла, репарация повреждений и апоптоз, в последнее время
активно исследуется феномен преждевременного старения клеток (Wang, Jang, 2009;
Brandl et al., 2011b; Kim et al., 2011; Alekseenko et al., 2012; Cmielova et al., 2012; Ko et al.,
2012; Larsen et al., 2012; Burova et al., 2013). Существенным является то, что стареющие
МСК, оставаясь метаболически активными, находятся в состоянии необратимого ареста
клеточного цикла и, соответственно, утрачивают способность регенерировать
поврежденные ткани. Эти факты подчеркивают необходимость исследования механизмов,
лежащих в основе преждевременного старения стволовых клеток. Основной пул данных о
преждевременном старении МСК в условиях окислительного стресса получен на МСК,
выделенных из костного мозга и пуповинной крови. Важно подчеркнуть, что до недавнего
времени в литературе полностью отсутствовали сведения о стресс-индуцированном
старении эМСК. Однако в 2013 году сотрудниками нашего отдела было убедительно
продемонстрировано, что в условиях сублетального окислительного стресса эМСК
подвергаются преждевременному старению, которое сопровождается соответствующими
фенотипическими изменениями клеток и необратимой потерей пролиферации (Burova et
al., 2013). При исследовании механизма, лежащего в основе стресс-индуцированного
старения эМСК, мы обнаружили, что в Н 2О2-обработанных клетках активируются
р53/p21/Rb и p38 MAPK сигнальные каскады (Borodkina et al., 2014). На основании
литературных данных мы предположили, что mTORС1 путь также может быть вовлечен в
развитие преждевременного старения эМСК. Таким образом, в настоящей работе
представлялось важным изучить роль mTORС1 и его основных регуляторов в процессе
Н2О2-индуцированного старения эМСК.
Цель: исследование роли mTORС1 сигнального пути в регуляции Н2О2 -
индуцированного старения эндометриальных стволовых клеток человека.
Задачи:
1. Выявление эффектов рапамицина на активность компонентов mTORC1
сигнального пути в Н2О2 -обработанных эМСК
2. Оценка влияния ингибирования mTORС1 на пролиферативный статус, активность
р53/р21/Rb сигнального пути и фенотип стареющих эМСК
3. Анализ влияния mTORC1 на Raf/MEK/ERK/p90RSK сигнальный каскад в Н2О2-
обработанных эМСК
4. Установление роли AKT киназы в регуляции mTORC1 пути при преждевременном
старении эМСК
5. Исследование характера изменения основных признаков старения Н2О2-
обработанных эМСК и активности р53/р21/Rb сигнального пути в условиях
ингибирования AKT
6. Выявление роли ERK1/2 в регуляции mTORC1 пути при стресс-индуцированном
старении эМСК
7. Оценка маркеров преждевременного старения эМСК в условиях ингибирования
активности ERK1/2
8. Изучение роли AMPK в регуляции mTORC1 пути в процессе Н2О2-
индуцированного старения эМСК.
Купить