Депо-управляемый вход кальция во взрослых кардиомиоцитах мыши
|
Список используемых сокращений...................................................................стр3
Введение.....................................................................................................стр4
Цели и задачи исследования............................................................................стр5
1.Обзор литературы.......................................................................................стр6
1.1 Гомеостазис кальция в клетке...............................................................................стр6
1.2 Особенности кальциевой сигнализации в кардиомиоцитах.............................стр7
1.3 Депо-управляемый вход кальция........................................................................стр10
1.4 Белковый аппарат депо-управляемого входа кальция......................................стр11
1.5 Особенности депо-управляемого входа кальция в кардиомиоцитах..............стр13
1.6 Мышиная модель заболевания миодистрофии Дюшенна................................стр15
2. Материалы и методы..........................................................................................................стр17
2.1 Получение первичной культуры желудочковых кардиомиоцитов взрослой мыши
(Mus musculus) .......................................................................................................................стр17
2.2 Получение лизатов желудочковых кардиомиоцитов взрослой мыши (Mus
musculus)..................................................................................................................................стр17
2.3 Электорфорез и иммуноблоттинг .....................................................................стр18
2.4 Электрофизиологические исследования........................................................стр19
2.5 Растворы для электрофизиологических измерений..........................................стр19
3. Результаты и обсуждение..................................................................................................стр20
3.1 Оптимизация условий для выделения культуры кардиомиоцитов желудочков
сердца взрослой мыши..........................................................................................................стр20
3.2 Токи кальция через потенциал-управляемые кальциевые каналы L-типа
(Ca v1.2)....................................................................................................................................стр21
3.3 Депо-управляемые токи, соответствующие СRAC-каналам (ICRAC) .............стр22
3.4 Экспрессия белков аппарата депо-управляемого входа кальция
.................................................................................................................................................стр26
Заключение...............................................................................................стр30
Выводы....................................................................................................................................стр31
Список цитируемой литературы...........................................................................................стр32
Введение.....................................................................................................стр4
Цели и задачи исследования............................................................................стр5
1.Обзор литературы.......................................................................................стр6
1.1 Гомеостазис кальция в клетке...............................................................................стр6
1.2 Особенности кальциевой сигнализации в кардиомиоцитах.............................стр7
1.3 Депо-управляемый вход кальция........................................................................стр10
1.4 Белковый аппарат депо-управляемого входа кальция......................................стр11
1.5 Особенности депо-управляемого входа кальция в кардиомиоцитах..............стр13
1.6 Мышиная модель заболевания миодистрофии Дюшенна................................стр15
2. Материалы и методы..........................................................................................................стр17
2.1 Получение первичной культуры желудочковых кардиомиоцитов взрослой мыши
(Mus musculus) .......................................................................................................................стр17
2.2 Получение лизатов желудочковых кардиомиоцитов взрослой мыши (Mus
musculus)..................................................................................................................................стр17
2.3 Электорфорез и иммуноблоттинг .....................................................................стр18
2.4 Электрофизиологические исследования........................................................стр19
2.5 Растворы для электрофизиологических измерений..........................................стр19
3. Результаты и обсуждение..................................................................................................стр20
3.1 Оптимизация условий для выделения культуры кардиомиоцитов желудочков
сердца взрослой мыши..........................................................................................................стр20
3.2 Токи кальция через потенциал-управляемые кальциевые каналы L-типа
(Ca v1.2)....................................................................................................................................стр21
3.3 Депо-управляемые токи, соответствующие СRAC-каналам (ICRAC) .............стр22
3.4 Экспрессия белков аппарата депо-управляемого входа кальция
.................................................................................................................................................стр26
Заключение...............................................................................................стр30
Выводы....................................................................................................................................стр31
Список цитируемой литературы...........................................................................................стр32
Кальций — один из наиболее распространенных вторичных мессенджеров,
вовлеченных в многочисленные сигнальные каскады. Посредством локальных осцилляций
кальция и колокализованного взаимодействия с молекулярным окружением достигается
инвариантность передачи сигнала по строго заданному пути. В целом, кальциевый
сигналинг вовлечен в большинство клеточных процессов от пролиферации и
дифференцировки клеток до сократительной способности миоцитов и апоптоза. Поэтому
поддержание гомеостазиса кальция в клетке жизненно важно и строго регулируется, а
нарушение кальциевого гомеостазиса может приводить к тяжелым патологиям
(Betzenhauser et al., 2015)
В настоящее время бурное развитие получила область медицины, занимающаяся
каналопатиями. Каналопатии — это группа заболеваний, связанных с нарушениями
функционирования ионных каналов (Baker et al., 2018), в частности кальциевых каналов
(Betzenhauser et al., 2015). По данным Всемирной организации здравоохранения на
сегодняшний день сердечные патологии занимают первое место в мире среди причин,
приводящих к летальному исходу. Показано, что происходит угнетение насосной функции
сердца и развитие аритмий из-за дисфункции потенциал-зависимых кальциевых каналов
(Betzenhauser et al., 2015) и рианодинового рецептора (Marx & Marks, 2013).
Одним из наиболее распространенных типов притока кальция внутрь клетки
является вход кальция через депо-управляемые каналы. Нарушения депо-управляемого
входа кальция отмечались при исследованиях различных заболеваний (Agnese Secondo et
al., 2018). Однако, вовлеченность депо-управляемого входа кальция в развитие сердечных
патологий остается противоречивой. В частности, высказывались гипотезы, что депо-
управляемый вход кальция отсутствует в нормальных зрелых кардиомиоцитах (Pan et al.,
2014; Zhao et al., 2015), проявляясь лишь в ранний постнатальный период (Voelkers et al.,
2010; Luo et al., 2012). Появляются работы, показывающие нарушение функций
кардиомиоцитов при дисфункциях STIM1 (Stromal Interaction Molecule) и белков семейств
Orai и TRPC (Transient Receptor Potential Canonical), традиционно относящихся к аппарату,
обеспечивающему функционирование депо-управляемых каналов в различных клетках
(Сollims et al., 2013; Sabourin et. al., 2016). Возможно, что депо-управляемый вход кальция
начинает играть важную роль в зрелых кардиомиоцитах только при развитии
патологических процессов (Wen et al., 2011; Luo et al., 2012). Таким образом, депо-
управляемые кальциевые каналы могут стать новой потенциальной мишенью для
воздействия лекарственных агентов при терапии сердечных заболеваний. Несмотря на
высокую актуальность изучения депо-управляемых каналов, на данный момент в мире
практически отсутствуют электрофизиологические записи их активности в
зрелых кардиомиоцитах.
Основная часть данной работы направлена на измерение депо-управляемого входа
кальция в нормальных клетках и при патологии, что позволит разрешить вопорс о
наличии функционального депо-управляемого входа кальция в зрелых кардиомиоцитах
мыши и оценить вовлеченность депо-управляемого входа кальция в развитие такой
сердечной патологии, как миодистрофия Дюшенна.
вовлеченных в многочисленные сигнальные каскады. Посредством локальных осцилляций
кальция и колокализованного взаимодействия с молекулярным окружением достигается
инвариантность передачи сигнала по строго заданному пути. В целом, кальциевый
сигналинг вовлечен в большинство клеточных процессов от пролиферации и
дифференцировки клеток до сократительной способности миоцитов и апоптоза. Поэтому
поддержание гомеостазиса кальция в клетке жизненно важно и строго регулируется, а
нарушение кальциевого гомеостазиса может приводить к тяжелым патологиям
(Betzenhauser et al., 2015)
В настоящее время бурное развитие получила область медицины, занимающаяся
каналопатиями. Каналопатии — это группа заболеваний, связанных с нарушениями
функционирования ионных каналов (Baker et al., 2018), в частности кальциевых каналов
(Betzenhauser et al., 2015). По данным Всемирной организации здравоохранения на
сегодняшний день сердечные патологии занимают первое место в мире среди причин,
приводящих к летальному исходу. Показано, что происходит угнетение насосной функции
сердца и развитие аритмий из-за дисфункции потенциал-зависимых кальциевых каналов
(Betzenhauser et al., 2015) и рианодинового рецептора (Marx & Marks, 2013).
Одним из наиболее распространенных типов притока кальция внутрь клетки
является вход кальция через депо-управляемые каналы. Нарушения депо-управляемого
входа кальция отмечались при исследованиях различных заболеваний (Agnese Secondo et
al., 2018). Однако, вовлеченность депо-управляемого входа кальция в развитие сердечных
патологий остается противоречивой. В частности, высказывались гипотезы, что депо-
управляемый вход кальция отсутствует в нормальных зрелых кардиомиоцитах (Pan et al.,
2014; Zhao et al., 2015), проявляясь лишь в ранний постнатальный период (Voelkers et al.,
2010; Luo et al., 2012). Появляются работы, показывающие нарушение функций
кардиомиоцитов при дисфункциях STIM1 (Stromal Interaction Molecule) и белков семейств
Orai и TRPC (Transient Receptor Potential Canonical), традиционно относящихся к аппарату,
обеспечивающему функционирование депо-управляемых каналов в различных клетках
(Сollims et al., 2013; Sabourin et. al., 2016). Возможно, что депо-управляемый вход кальция
начинает играть важную роль в зрелых кардиомиоцитах только при развитии
патологических процессов (Wen et al., 2011; Luo et al., 2012). Таким образом, депо-
управляемые кальциевые каналы могут стать новой потенциальной мишенью для
воздействия лекарственных агентов при терапии сердечных заболеваний. Несмотря на
высокую актуальность изучения депо-управляемых каналов, на данный момент в мире
практически отсутствуют электрофизиологические записи их активности в
зрелых кардиомиоцитах.
Основная часть данной работы направлена на измерение депо-управляемого входа
кальция в нормальных клетках и при патологии, что позволит разрешить вопорс о
наличии функционального депо-управляемого входа кальция в зрелых кардиомиоцитах
мыши и оценить вовлеченность депо-управляемого входа кальция в развитие такой
сердечной патологии, как миодистрофия Дюшенна.
В данной работе мы проверяли гипотезу о наличии депо-управляемого входа
кальция в зрелых кардиомиоцитах. К настоящему моменту практически отсутствуют
электрофизиологические записи депо-управляемых токов кальция в зрелых
кардиомиоцитах, а его роль в остается противоречивой.
В ходе работы нам удалось электрофизиологически зафиксировать депо-
управляемые токи кальция у мышей дикого типа. Полученные данные позволяют сделать
вывод о наличии депо управляемого входа кальция в зрелых кардиомиоцитах без
патологий. Таким образом, мы можем заключить, что гипотезы о наличии депо-
управляемого входа кальция исключительно в неонатальных кардиомиоцитах являются
несостоятельными. Тем не менее его функциональная роль в клетке пока не ясна и,
вероятно, не связана с сократительной функцией кардиомиоцитов. Можно предположить,
что депо-управляемый вход кальция участвует в активации кальций-зависимых
транскрипционных факторов, по аналогии как показано на неонатальных кардиомиоцитах,
где депо-управляемый вход кальция участвует в модуляции NFAT сигналинга, нарушение
которого приводит к гипертрофии кардиомиоцитов (Voelkers et al., 2010).
К сожалению, нам пока не удалось провести аналогичные эксперименты на зрелых
кардиомиоцитах мыши линии mdx, поэтому вопрос об участии депо-управляемого входа
кальция в развитии миодистрофии Дюшенна остаётся открытым.
Мы записали потенциал управляемые кальциевые тока через каналы L-типа.
Полученные нами данные показывают отсутствие разницы в амплитудах кальциевых
токов у взрослых мышей дикого типа и линии mdx, что согласуется с литературными данными.
Результаты биохимических исследований показывают отсутствие разницы в экспрессии
основных каналообразующих белков депо-управляемого входа кальция – Orai1 и Orai3.
кальция в зрелых кардиомиоцитах. К настоящему моменту практически отсутствуют
электрофизиологические записи депо-управляемых токов кальция в зрелых
кардиомиоцитах, а его роль в остается противоречивой.
В ходе работы нам удалось электрофизиологически зафиксировать депо-
управляемые токи кальция у мышей дикого типа. Полученные данные позволяют сделать
вывод о наличии депо управляемого входа кальция в зрелых кардиомиоцитах без
патологий. Таким образом, мы можем заключить, что гипотезы о наличии депо-
управляемого входа кальция исключительно в неонатальных кардиомиоцитах являются
несостоятельными. Тем не менее его функциональная роль в клетке пока не ясна и,
вероятно, не связана с сократительной функцией кардиомиоцитов. Можно предположить,
что депо-управляемый вход кальция участвует в активации кальций-зависимых
транскрипционных факторов, по аналогии как показано на неонатальных кардиомиоцитах,
где депо-управляемый вход кальция участвует в модуляции NFAT сигналинга, нарушение
которого приводит к гипертрофии кардиомиоцитов (Voelkers et al., 2010).
К сожалению, нам пока не удалось провести аналогичные эксперименты на зрелых
кардиомиоцитах мыши линии mdx, поэтому вопрос об участии депо-управляемого входа
кальция в развитии миодистрофии Дюшенна остаётся открытым.
Мы записали потенциал управляемые кальциевые тока через каналы L-типа.
Полученные нами данные показывают отсутствие разницы в амплитудах кальциевых
токов у взрослых мышей дикого типа и линии mdx, что согласуется с литературными данными.
Результаты биохимических исследований показывают отсутствие разницы в экспрессии
основных каналообразующих белков депо-управляемого входа кальция – Orai1 и Orai3.
