Использование технологии CRISPR/Cas9 для получения мутантов по генам транспортеров серотонина у Danio rerio
|
Список условных обозначений и сокращений 4
Введение 5
1. Обзор литературы 8
1.1. Danio rerio как модельный объект для генетических манипуляций 8
1.2. Система CRISPR/Cas9 как технология редактировании геномов 11
1.3. Транспортеры серотонина у человека и других млекопитающих 17
1.4. Транспортеры серотонина у Danio rerio 19
2. Материалы и методы 22
2.1. Праймеры 22
2.2 Среды и растворы, использованные в работе 22
2.3. Методы работы с бактериями и плазмидами 23
2.3.1. Приготовление химически компетентных Escherichia coli 23
2.3.2. Трансформация бактерий Escherichia coli 24
2.3.3. Выделение плазмид из культур E. coli 24
2.4. Создание плазмидных векторов для технологии CRISPR/Cas9 25
2.4.1. Дизайн олигонуклеотидов для CRISPR/Cas9 25
2.4.2. Конструирование плазмид для технологии CRISPR/Cas9 27
2.4.3. Валидация векторов для CRISPR/Cas9 при помощи ПЦР и секвенирования 28
2.5. Методы работы с Danio rerio 29
2.5.1. Условия содержания рыб 29
2.5.2. Скрещивание D. rerio 29
2.5.3. Проведение микроинъекций 29
2.6. Методы, использованные для генотипирования особей 30
2.6.1. Получение образцов тканей (хвостовых плавников) и выделение из них геномной ДНК 30
2.6.2. Генотипирование особей при помощи полимеразной цепной реакции 30
2.6.3. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 32
2.6.4. Подготовка к секвенированию участков генов интереса 32
2.7. Методы работы с РНК 35
2.7.1. Транскрипция РНК-гидов in vitro 35
2.7.2. Денатурирующий электрофорез РНК в агарозном геле 35
3. Результаты 37
3.1. Конструирование плазмид для технологии CRISPR/Cas9 37
3.2. Микроинъекции плазмидной ДНК в икру Danio rerio 42
3.3. Генотипирование особей Danio rerio при помощи методов полимеразной цепной реакции и секвенирования ДНК 43
3.4. Работа с РНК 47
Обсуждение 49
Выводы 53
Благодарности 54
Список использованной литературы 55
Введение 5
1. Обзор литературы 8
1.1. Danio rerio как модельный объект для генетических манипуляций 8
1.2. Система CRISPR/Cas9 как технология редактировании геномов 11
1.3. Транспортеры серотонина у человека и других млекопитающих 17
1.4. Транспортеры серотонина у Danio rerio 19
2. Материалы и методы 22
2.1. Праймеры 22
2.2 Среды и растворы, использованные в работе 22
2.3. Методы работы с бактериями и плазмидами 23
2.3.1. Приготовление химически компетентных Escherichia coli 23
2.3.2. Трансформация бактерий Escherichia coli 24
2.3.3. Выделение плазмид из культур E. coli 24
2.4. Создание плазмидных векторов для технологии CRISPR/Cas9 25
2.4.1. Дизайн олигонуклеотидов для CRISPR/Cas9 25
2.4.2. Конструирование плазмид для технологии CRISPR/Cas9 27
2.4.3. Валидация векторов для CRISPR/Cas9 при помощи ПЦР и секвенирования 28
2.5. Методы работы с Danio rerio 29
2.5.1. Условия содержания рыб 29
2.5.2. Скрещивание D. rerio 29
2.5.3. Проведение микроинъекций 29
2.6. Методы, использованные для генотипирования особей 30
2.6.1. Получение образцов тканей (хвостовых плавников) и выделение из них геномной ДНК 30
2.6.2. Генотипирование особей при помощи полимеразной цепной реакции 30
2.6.3. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 32
2.6.4. Подготовка к секвенированию участков генов интереса 32
2.7. Методы работы с РНК 35
2.7.1. Транскрипция РНК-гидов in vitro 35
2.7.2. Денатурирующий электрофорез РНК в агарозном геле 35
3. Результаты 37
3.1. Конструирование плазмид для технологии CRISPR/Cas9 37
3.2. Микроинъекции плазмидной ДНК в икру Danio rerio 42
3.3. Генотипирование особей Danio rerio при помощи методов полимеразной цепной реакции и секвенирования ДНК 43
3.4. Работа с РНК 47
Обсуждение 49
Выводы 53
Благодарности 54
Список использованной литературы 55
Технология CRISPR/Cas9 - новейший метод редактирования геномов, основанный на особом адаптивном иммунитете прокариот. В общем случае для её применения необходимы лишь РНК-гид и нуклеаза Cas9, вносящая в ДНК двунитевые разрывы. Последовательность РНК-гида включает участок, соответствующий выбранной в геноме последовательности мишени, и шпильку, необходимую для образования комплекса с нуклеазой, благодаря которым он направляет активность Cas9 на мишень. Два эти элемента в том или ином виде (плазмидные векторы для экспресии, РНК-гид и мРНК Cas9, РНК-гид и белок Cas9) вносят в клетки, геном которых хотят изменить. Двунитевой разрыв затем репарируется одним из двух путей: негомологичным объединением концов (вследствие этого образуются короткие делеции или инсерции) или гомологичной рекомбинацией с матрицей, либо имеющейся в клетке исходно, либо привнесенной в ходе опыта.
При помощи технологии CRISPR/Cas9 можно решать разнообразные задачи: получение точечных мутаций, делеции небольших участков и даже крупных фрагментов хромосом, внесение необходимых последовательностей в заранее определенное место генома, активация и подавление транскрипции генов и т.д. Ведутся работы по изучению возможности использования технологии CRISPR/Cas9 в терапевтических целях. Эта технология показала эффективность на широком спектре организмов, позволяя получать мутантные линии животных, растений и штаммы грибов за очень короткий срок.
В данной работе мы рассматриваем эффективность использования инъекций плазмидных векторов, содержащих последовательности для синтеза РНК-гидов и нуклеазы Cas9 под контролем сильных эукариотических промоторов, для внесения изменений в геном рыб Danio rerio.
Обычно плазмидные векторы используют для трансфекции клеточных культур, однако подобная система показала высокую эффективность для мыши Mus musculus (до 50% мутантных особей, в том числе гомозиготы) (Mashiko, Fujihara et al., 2013; Mashiko, Young et al., 2014), а также на Drosophila melanogaster - организме со столь же высокой скоростью дробления зиготы, как и у данио (5-25% мутантов, мутации в клетках зародышевой линии на уровне 1%) (Gratz, Cummings et al., 2013). Однако на данио плазмидные векторы такого типа впервые применены в данной работе.
Этот метод является более дешевым и простым, чем работа с РНК. Его оптимизация для использования и в других организмах (например, у D. rerio') может сделать эту технологию редактирования генома ещё более доступной и удобной.
Из всего перечня возможных модификаций мы решили остановиться на получении делеций протяженных участков выбранных генов по схеме, предлагающей использование двух РНК-гидов для одного гена - с мишенями в начале и в конце делетируемого участка (Kato, Hara et al., 2017; Wang, Geng et al., 2017).
B последнее время небольшая тропическая рыба Danio rerio стала популярным модельным объектом не только в биологии развития и генетике, но и начала играть большую роль в исследовании физиологии мозга и психических расстройств человека. Исходя из высокой генетической гомологии с человеком, удобства манипуляций с эмбрионами, простоты и дешевизны содержания, эти рыбы всё чаще становятся объектом исследований нейронаук и вовлекаются в скрининг психотропных препаратов (Gerlai, 2013; Stewart, Gerlai et al., 2015; Stewart, Grieco et al., 2015).
При общем генетическом сходстве с млекопитающими, данио и другие представители Teleostei имеют и ряд ключевых отличий. Так, предок всех костистых рыб претерпел дополнительный раунд дупликации всего генома, что вызвало появление генов, кодирующих белки со сходными функциональными ролями, в том числе и участников систем передачи сигналов в мозге (Meyer and Malaga-Trillo, 1999), среди которых есть и два транспортера серотонина.
Понимание того, существуют ли различия между функциями подобных белков у данио, немаловажно и при тестировании на этих рыбах психотропных препаратов. Например, для разработки ингибиторов обратного захвата серотонина, применяющихся при депрессии, важно, за какие из детектируемых эффектов отвечает каждый из транспортеров (например, снижение уровня тревожности при воздействии препарата (Abreu, Koakoski et al., 2014; Egan, Bergner et al., 2009)).
Данные транспортеры имеют различную локализацию в мозге, что должно сопровождаться и функциональной специализацией. Изучение различий функций двух этих транспортеров на уровне характеристики поведенческого фенотипа ранее не проводили, несмотря на наличие некоторых мутантных (полученных в ходе ненаправленного мутагенеза и имеющих однонуклеотидные замены в данных генах) форм в банках генетических линий D. rerio. Этими фактами и обусловлен выбор генов, функции которых мы хотели бы изменить.
Целью данной работы было получить и опробовать плазмидные векторы, используемые в технологии CPISPR/Cas9, для получения особей Danio rerio, мутантных по генам транспортеров серотонина.
Для достижения этой цели был поставлен ряд задач:
1. Ознакомиться с методикой подбора последовательностей мишеней для системы CPISPR/Cas9 и выбрать по 2 мишени для каждого из двух выбранных генов.
2. Получить плазмиды, используемые в технологии CPISPR/Cas9, необходимые для синтеза РНК-гидов и содержащие ген cas9 под контролем эукариотического промотора
3. Освоить метод микроинъекций в эмбрионы данио на ранних этапах развития.
4. Подобрать методику отбора мутантных особей и освоить методы, необходимые для проведения отбора. Произвести анализ полученных после микроинъекций особей.
При помощи технологии CRISPR/Cas9 можно решать разнообразные задачи: получение точечных мутаций, делеции небольших участков и даже крупных фрагментов хромосом, внесение необходимых последовательностей в заранее определенное место генома, активация и подавление транскрипции генов и т.д. Ведутся работы по изучению возможности использования технологии CRISPR/Cas9 в терапевтических целях. Эта технология показала эффективность на широком спектре организмов, позволяя получать мутантные линии животных, растений и штаммы грибов за очень короткий срок.
В данной работе мы рассматриваем эффективность использования инъекций плазмидных векторов, содержащих последовательности для синтеза РНК-гидов и нуклеазы Cas9 под контролем сильных эукариотических промоторов, для внесения изменений в геном рыб Danio rerio.
Обычно плазмидные векторы используют для трансфекции клеточных культур, однако подобная система показала высокую эффективность для мыши Mus musculus (до 50% мутантных особей, в том числе гомозиготы) (Mashiko, Fujihara et al., 2013; Mashiko, Young et al., 2014), а также на Drosophila melanogaster - организме со столь же высокой скоростью дробления зиготы, как и у данио (5-25% мутантов, мутации в клетках зародышевой линии на уровне 1%) (Gratz, Cummings et al., 2013). Однако на данио плазмидные векторы такого типа впервые применены в данной работе.
Этот метод является более дешевым и простым, чем работа с РНК. Его оптимизация для использования и в других организмах (например, у D. rerio') может сделать эту технологию редактирования генома ещё более доступной и удобной.
Из всего перечня возможных модификаций мы решили остановиться на получении делеций протяженных участков выбранных генов по схеме, предлагающей использование двух РНК-гидов для одного гена - с мишенями в начале и в конце делетируемого участка (Kato, Hara et al., 2017; Wang, Geng et al., 2017).
B последнее время небольшая тропическая рыба Danio rerio стала популярным модельным объектом не только в биологии развития и генетике, но и начала играть большую роль в исследовании физиологии мозга и психических расстройств человека. Исходя из высокой генетической гомологии с человеком, удобства манипуляций с эмбрионами, простоты и дешевизны содержания, эти рыбы всё чаще становятся объектом исследований нейронаук и вовлекаются в скрининг психотропных препаратов (Gerlai, 2013; Stewart, Gerlai et al., 2015; Stewart, Grieco et al., 2015).
При общем генетическом сходстве с млекопитающими, данио и другие представители Teleostei имеют и ряд ключевых отличий. Так, предок всех костистых рыб претерпел дополнительный раунд дупликации всего генома, что вызвало появление генов, кодирующих белки со сходными функциональными ролями, в том числе и участников систем передачи сигналов в мозге (Meyer and Malaga-Trillo, 1999), среди которых есть и два транспортера серотонина.
Понимание того, существуют ли различия между функциями подобных белков у данио, немаловажно и при тестировании на этих рыбах психотропных препаратов. Например, для разработки ингибиторов обратного захвата серотонина, применяющихся при депрессии, важно, за какие из детектируемых эффектов отвечает каждый из транспортеров (например, снижение уровня тревожности при воздействии препарата (Abreu, Koakoski et al., 2014; Egan, Bergner et al., 2009)).
Данные транспортеры имеют различную локализацию в мозге, что должно сопровождаться и функциональной специализацией. Изучение различий функций двух этих транспортеров на уровне характеристики поведенческого фенотипа ранее не проводили, несмотря на наличие некоторых мутантных (полученных в ходе ненаправленного мутагенеза и имеющих однонуклеотидные замены в данных генах) форм в банках генетических линий D. rerio. Этими фактами и обусловлен выбор генов, функции которых мы хотели бы изменить.
Целью данной работы было получить и опробовать плазмидные векторы, используемые в технологии CPISPR/Cas9, для получения особей Danio rerio, мутантных по генам транспортеров серотонина.
Для достижения этой цели был поставлен ряд задач:
1. Ознакомиться с методикой подбора последовательностей мишеней для системы CPISPR/Cas9 и выбрать по 2 мишени для каждого из двух выбранных генов.
2. Получить плазмиды, используемые в технологии CPISPR/Cas9, необходимые для синтеза РНК-гидов и содержащие ген cas9 под контролем эукариотического промотора
3. Освоить метод микроинъекций в эмбрионы данио на ранних этапах развития.
4. Подобрать методику отбора мутантных особей и освоить методы, необходимые для проведения отбора. Произвести анализ полученных после микроинъекций особей.
Выводы:
1. Освоены методы, необходимые для использования технологии CRISPR/Cas9 на Danio rerio (работа с плазмидами, микроинъекции ДНК- и РНК-конструкций в икру, транскрипция in vitro и дальнейшая работа с РНК, генотипирование особей методами ПИР и секвенирования участков генов и т.д.).
2. Сконструированы векторы на основе плазмиды PX458 для внесения изменений в гены транспортеров серотонина у данио. Экспериментально подтверждено, что они содержат необходимые последовательности.
3. Гены, содержащиеся на плазмиде, экспрессируются in vivo в живых эмбрионах данио.
4. Анализ особей после инъекции созданных генетических конструкций в оплодотворенную икру пока не обнаружил крупных делеций или других нарушений последовательности генов транспортеров серотонина.
1. Освоены методы, необходимые для использования технологии CRISPR/Cas9 на Danio rerio (работа с плазмидами, микроинъекции ДНК- и РНК-конструкций в икру, транскрипция in vitro и дальнейшая работа с РНК, генотипирование особей методами ПИР и секвенирования участков генов и т.д.).
2. Сконструированы векторы на основе плазмиды PX458 для внесения изменений в гены транспортеров серотонина у данио. Экспериментально подтверждено, что они содержат необходимые последовательности.
3. Гены, содержащиеся на плазмиде, экспрессируются in vivo в живых эмбрионах данио.
4. Анализ особей после инъекции созданных генетических конструкций в оплодотворенную икру пока не обнаружил крупных делеций или других нарушений последовательности генов транспортеров серотонина.
