Протеасома является крупным мультисубъединичным белковым комплексом, осуществляющим убиквитин-зависимую деградацию белков в клетках эукариот (Maupin- Furlow et al., 2006). Исследования последних лет обнаружили присутствие протеасом также и во внеклеточном пространстве: в плазме крови, спинномозговой жидкости, альвеолярном секрете, в кондиционированной культурами клеток питательной среде (Wada et al., 1993, Roth et al., 2005, Egerer et al., 2002). Роль протеасом во внеклеточном пространстве неизвестна, однако, замечена прямая зависимость между количеством внеклеточных протеасом в плазме крови и тяжестью онкологических заболеваний пациентов (Wada et al., 1993). Аналогичная связь выявлена у пациентов, страдающих заболеваниями печени (цирроз, острый или хронический гепатит, жировая дистрофия) (Wada et al., 1993), а также аутоиммунными заболеваниями (аутоиммунный миозит, системная красная волчанка, синдром Шегрена, ревматоидный артрит и аутоиммунный гепатит) (Egerer et al., 2002). Данное наблюдение открывает перспективы в диагностике патогенных процессов в организме, что подстегивает исследования, направленные на определение количества протеасом в плазме крови пациентов при различных заболеваниях. Кроме того, было замечено, что после проведения стандартной или усиленной химиотерапии уровень протеасом в плазме крови тех пациентов, лечение для которых было успешным, достоверно снижался; такого эффекта не наблюдалось у неподдающихся химиотерапии больных (Wada et al., 1993, Stoebner et al., 2005). Взаимозависимость между стадией онкологического заболевания и концентрацией внеклеточных протеасом была также обнаружена у пациентов с метастазирующей злокачественной меланомой (Stoebner et al., 2005). Значимо повышенные концентрации внеклеточных протеасом также наблюдались у пациентов с различными солидными опухолями (Lavabre-Bertrand et al., 2001, Dutaud et al., 2002). Таким образом, это позволяет рассматривать внеклеточные протеасомы как возможный прогностический параметр в исходе заболеваний. Нельзя, однако, не отметить тот факт, что, в других исследованиях показано, что наибольший рост концентрации внеклеточных протеасом в плазме крови происходит при значительном прогрессировании онкологического заболевания (Lavabre- Bertrand et al., 2001). Кроме того, у пациентов, больных некоторыми формами лимфомы или лимфоцитарным лейкозом, напротив, наблюдалось пониженное количество внеклеточных протеасом по сравнению со здоровыми донорами (Lavabre-Bertrand et al., 2001).
Несмотря на большое количество данных, касающихся исследованию концентрации и активности внеклеточных протеасом у пациентов, страдающих тем или иным заболеванием, свойства секретируемых клетками протеасом или механизм их секреции на сегодняшний день не исследованы, что отдаляет перспективу использования внеклеточных протеасом в качестве маркеров онкологических и других заболеваний. Чтобы приблизиться к пониманию роли протеасом во внеклеточном пространстве, необходимо определить специфические особенности, в том числе посттрансляционные модификации белков внеклеточных протеасом в сравнении с внутриклеточными комплексами, и ответить на вопрос, какие механизмы задействованы в их транспорте во внеклеточное пространство.
Выводы:
1. С помощью масс-спектрометрического анализа идентифицированы 55 посттрансляционных модификаций у клеточных и 31 - у внеклеточных протеасом, аффинно-очищенных из клеток К562 и кондиционированной клетками среды. Из списка выявленных посттрансляционных модификаций клеточных и внеклеточных протеасом, соответственно, 36 и 21 идентифицированы нами впервые.
2. По результатам МС-анализа фосфорилирование по серину в 181-м положении в субъединице РЗ (PSMB3) нами обнаружено впервые и потенциально является специфичной посттрансляционной модификацией для внеклеточных протеасом.
3. Получены и апробированы плазмидные конструкции рХЗЗО системы CRISPR/Cas9, содержащие последовательности гид-РНК, нацеленные на второй и третий экзоны гена субъединицы РЗ (PSMB3) протеасомы с целью дальнейшего нокаута по гену PSMB3 доксициклин-регулируемых клеточный линий.
4. Получена линия клеток K562, стабильно экспрессирующая генетическую конструкцию, кодирующую субъединицу протеасом РЗ (PSMB3) слитую на N- конце с последовательностью T7, с целью дальнейшего получения линий клеток HeLa, стабильно экспрессирующих нормальную и, созданную нами, мутантную последовательности.
