ОГЛАВЛЕНИЕ 2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 3
ВВЕДЕНИЕ 4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1 Гематоэнцефалический барьер 6
1.2 Основные белки плотных контактов гематоэнцефалического барьера 10
1.3 Миодистрофия Дюшенна 12
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 15
2.1 Приподнятый крестообразный лабиринт 15
2.2 Тест Порсолта 16
2.3 Вестерн-блот 18
2.4 Статистическая обработка результатов 20
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 21
3.1 Оценка локомоторной активности у мышей mdx и C57BL. 21
3.2 Оценка уровня тревожности у мышей mdx и C57BL. 23
3.3 Оценка депрессивно-подобного состояния мышей mdx и C57BL. 25
3.4 Определение уровня белков плотных контактов в головном мозге мышей mdx и C57BL. 27
4. ВЫВОДЫ 30
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 31
БЛАГОДАРНОСТИ
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) – это физиологический барьер, основная функция которого заключается в поддержании постоянства тканевой среды головного мозга для обеспечения нормального функционирования нейронов. Данная функция осуществляется путём контроля транспорта веществ и клеток между кровеносным руслом и тканями мозга. Гематоэнцефалический барьер образован эндотелиальными клетками, базальной мембраной, перицитами и астроцитами, тесно взаимодействующими друг с другом.
Существуют два пути транспорта через гематоэнцефалический барьер – трансцеллюлярный и парацеллюлярный. Белки плотных контактов, расположенные между эндотелиоцитами кровеносных сосудов, представляют собой важный компонент регуляции парацеллюлярного транспорта.
Основными белками плотных контактов являются клаудины, при этом клаудин-5 считается необходимым для обеспечения барьерных функций эндотелия сосудов мозга. Было установлено, что у мышей, нокаутных по клаудину-5, значительно повышается парацеллюлярная проницаемость в головном мозге при сохранении структуры плотных контактов (Nitta et al., 2003). Помимо него к важным маркерам эндотелия гематоэнцефалического барьера относится и другой трансмембранный белок плотных контактов – окклюдин, функции которого связывают с ограничением парацеллюлярной проницаемости для макромолекул (Al-Sadi et al., 2011), а также с обеспечением ветвления нитей плотных контактов (Saito et al., 2021).
Дисфункция плотных контактов и нарушение функций гематоэнцефалического барьера ассоциированы с развитием некоторых психоневрологических нарушений, таких как рассеянный склероз, шизофрения, расстройства аутистического спектра (РАС) и депрессия (Greene et al., 2019; Kealy et al., 2020).
Существует ряд соматических заболеваний, в которых могут проявляться психоневрологические синдромы, схожие с перечисленными выше, такие как повышенная тревожность и депрессия. К подобным заболеваниям относится миодистрофия Дюшенна (МДД).Данная патология относится к дистрофинопатиям – группе наследственных рецессивных X-сцепленных заболеваний, вызванных мутациями в гене дистрофина. При миодистрофии Дюшенна мутации вызывают сдвиг рамки считывания и преждевременное появление стоп-кодона, из-за чего синтезируется нефункциональный белок дистрофин. Связанный с дистрофином белковый комплекс обеспечивает амортизирующую связь между цитоскелетом и внеклеточным матриксом, играя важную роль в стабилизации мышечных волокон и сопротивлении механическому стрессу при мышечном сокращении(Leyva-Leyva etal., 2018). В связи с этим патогенез МДД во многом объясняется разрушением дистрофин-ассоциированного белкового комплекса, снижением механической прочности мембраны и ускоренной дегенерацией мышечной ткани (Verhaart et al., 2019).
Помимо тяжелых мышечных симптомов, у пациентов с МДД часто выражены когнитивные и психоневрологические нарушения (Naidoo et al., 2020). Распространенность данных симптомов связывают с синаптическими нарушениями, а также с отсутствием укороченных форм дистрофина, преимущественно экспрессируемых в тканях головного мозга. Однако на данный момент нет достаточных сведений о нарушениях, связанных с потерей полноразмерной цепи дистрофина в эндотелиях сосудов головного мозга. Существует предположение, что потеря полноразмерных форм дистрофина в центральной нервной системе (ЦНС) ведёт к увеличению проницаемости гематоэнцефалического барьера (Nicoetal., 2004), однако остаётся малоизученным состояние белков плотных контактов в эндотелии кровеносных сосудов головного мозга при миодистрофии Дюшенна.
Одной из наиболее распространённых моделей МДД являются мыши mdx, несущие мутацию в гене дистрофина, приводящую к отсутствию синтеза полноразмерной формы данного белка (Sicinski et al., 1989). У мышей mdx в ряде исследований наблюдается повышенная тревожность и тоническая неподвижность, связанная со страхом (Vaillend et al., 2017), что свидетельствует о нарушениях в ЦНС. Исследование плотных контактов в эндотелии ГЭБ на данной модели позволит приблизиться к пониманию механизмов, затрагивающих изменения проницаемости сосудов головного мозга, связанные с потерей дистрофина.
Целью данной работыявляется оценка уровня белков плотных контактов в эндотелии сосудов головного мозга у мышей mdx и C57BL и оценка их тревожности.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Оценка локомоторной активности мышей mdx и C57BL в приподнятом крестообразном лабиринте.
2. Оценка уровня тревожности у мышей mdx и C57BL в приподнятом крестообразном лабиринте.
3. Оценка уровня депрессивно-подобного состояния у мышей mdx и C57BL с помощью теста Порсолта.
4. Анализ уровня окклюдина и клаудина-5 в головном мозге мышей mdx и C57BL с помощью метода вестерн блот.
1. У мышей mdx обнаружено достоверное снижение общей пройденной дистанции, а также дистанции, пройденной в закрытых рукавах в тесте приподнятый крестообразный лабиринт, что может указывать на снижение локомоторной активности у мышей mdx по сравнению с контрольной группой мышей C57BL.
2. Мыши mdx достоверно не отличались от контрольной группы мышей C57BL по времени пребывания в открытых рукавахи по отношению дистанции, пройденной в открытых рукавах к общей пройденной дистанции, что может свидетельствовать об отсутствии повышенной тревожности у мышей mdx.
3. Тест Порсолта показал отсутствие у мышей mdx депрессивно-подобного состояния по сравнению с контрольной группой мышей C57BL.
4. У мышей mdx не наблюдалось достоверного изменения уровня окклюдина и клаудина-5 по сравнению с контрольной группой мышей C57BL, что свидетельствует об отсутвии изменений в барьерном механизме эндотелия гематоэнцефалического барьера.
