СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 3
ВВЕДЕНИЕ 4
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
Протеасома. Строение и состав 6
Типы протеасом 9
Убиквитин протеасомный путь деградации белков 10
Процессинг 12
Убиквитин-независимый протеолиз 13
Участие убиквитин-протеасомной системы в клеточных процессах 14
Многообразие тубулинов. Функции 15
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 18
Работа с клетками эукариот в культуре 18
Молекулярно-биохимические и физико-химические методы 18
Методы работы с бактериями Escherichia coli 23
РЕЗУЛЬТАТЫ 25
Масс-спектрометрический анализ аффинно-очищенных протеасом 25
Верификация масс-спектрометрических данных с помощью иммуноблотинга 27
Создание генетических конструкций для экспрессии рекомбинантного а-тубулина 28
Подбор условий для экспрессии и очистки рекомбинантных а-тубулинов 30
Проверка результатов очистки рекомбинантного а-тубулина Вестерн-блот анализом 31
Протеолиз а-тубулина протеасомой in vitro 32
ОБСУЖДЕНИЕ 34
ВЫВОДЫ 39
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 39
ПРИЛОЖЕНИЕ А 45
Мультисубъединичный белковый комплекс, отвечающий за избирательную деградацию большинства белков в эукариотической клетке, называется 26 S протеасомой. За счет деградации специфических регуляторных белков она играет центральную роль в основных клеточных процессах: клеточной дифференцировке и развитии, транскрипции и репарации ДНК, продвижении клетки по клеточному циклу, иммунном и воспалительном ответах, апоптозе (Цимоха, 2010).
На сегодняшний день прослеживается связь между патогенезом различных заболеваний, включая нейродегенеративные, аутоимунные и онкологические, и нарушениями в работе убиквитин-протеасомной системы. Причинами заболеваний может стать как ингибирование работы этой протеолитической системы, так и ее чрезмерная активность. Тот факт, что работа протеасомы тесно связана с патогенезом многих заболеваний, наводит на мысль о возможности изменения течения этих заболеваний. Поэтому так важно широкое и комплексное изучение механизма работы убиквитин - протеасомной системы и способов регуляции функционирования протеасом в клетке.
Существует ряд белков с известными и неизвестными функциями, которые постоянно или краткосрочно связываются с 26S протеасомами, и условно поделены на две группы: белки убиквитиновой системы и белки, регулирующие активность и функции протеасом за счет прямого связывания. Определение белков, взаимодействующих с протеасомами, является одним из важных этапов в понимании функций протеасом в клетке и механизмов их регуляции.
Согласно данным нашей лаборатории, полученным с помощью iTRAQ-масс- спектрометрического анализа очищенных с помощью последовательного фракционирования протеасом (Зайкова и др., 2013), среди ассоциированных с протеасомами белков присутствуют такие белки цитоскелета, как а- и Р-тубулины, актин, а-актинин, миозин, филамин. Вестерн-блот анализ с применением моноклональных мышиных антител, специфичных к а-тубулину, подтвердил присутствие данного белка. Однако в комплексе с протеасомами была идентифицирована дополнительная изоформа а-тубулина с молекулярной массой примерно 40 кДа.
Известно, что, помимо полной деградации субстратов, протеасома способна к ограниченному протеолизу. Если субстрат расщепляется не полностью и при этом продукт расщепления остается функционально-активным, происходит так называемый "протеасомный процессинг" (Сорокин и др., 2009). Тем не менее, на сегодняшний день примеров белков, процессируемых протеасомой, всего несколько.
Можно предположить, что укороченная форма а-тубулина, обнаруженная в комплексе с очищенными протеасомами, возникает в результате процессинга а -тубулина протеасомами.
Цель работы
Исследование роли протеасом в появлении укороченной формы а-тубулина в клетках человека
Задачи
1 С помощью MALDI-ICR-масс-спектрометрии определить белки, ассоциированные с протеасомами, аффинно-очищенными из клеток человека линии К562
2 Выборочно подтвердить масс-спектрометрические данные Вестерн-блот анализом с помощью специфических антител
3 Исследовать протеолиз (или процессинг) а-тубулина протеасомами in vitro.
ВЫВОДЫ:
1 С помощью MALDI-ICR-масс-спектрометрии в комплексе с протеасомами, аффинно-очищенными из клеток человека линии К562, определены 16 белков, среди которых присутствуют белки убиквитин-протеасомной системы, шапероны, белки цитоскелета и участники метаболизма
2 Масс-спектрометрические данные подтверждены Вестерн-блот анализом с помощью специфических антител к a- и Р-тубулинам, Р-актину, БТШ70. Обнаружено, что с аффинно-очищенными протеасомами ассоциирована укороченная форма a-тубулина
3 В результате реакции протеолиза a-тубулина протеасомой установлено, что в системе in vitro экспрессированный в E.coli a-тубулин человека не подвергается процессингу и расщеплению протеасомой убиквитин-независимо.
