Полиморфизм генов CLE, регулирующих развитие симбиотических клубеньков у люцерны Medicago truncatula
|
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Пептиды CLE и их роль в развитии растений
1.2. Пептиды CLE в регуляции развития клубеньков
1.3. Полиморфизм и естественный отбор
1.4. Методы оценки полиморфизма генов у люцерны
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Растительный материал
2.2. Выделение растительной ДНК
2.3. Амплификация фрагментов генов CLE
2.4. Трансформация растений с помощью A. rhizogenes
2.5. Выделение РНК и обратная транскрипция
2.6. Проведение ПЦР в реальном времени
2.7. Биоинформатический анализ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Филогенетический анализ генов CLE
3.2. Распределение генов MtCLE по хромосомам
3.3. Оценка экспрессии генов MtCLE с помощью доступных транскриптомных данных
3.4. Оценка полиморфизма генов MtCLEлюцерны
3.5. Определение последовательностей фрагментов гена MtCLE34 с помощью секвенирования
3.6. Определение влияния отбора в участках генов MtCLE
3.7. Поиск ассоциаций полиморфизма генов MtCLE с количеством образующихся клубеньков
3.8. Изучение функциональной значимости гена MtCLE34 в регуляции развития симбиотических клубеньков у M. truncatula
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ
БЛАГОДАРНОСТИ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Пептиды CLE и их роль в развитии растений
1.2. Пептиды CLE в регуляции развития клубеньков
1.3. Полиморфизм и естественный отбор
1.4. Методы оценки полиморфизма генов у люцерны
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Растительный материал
2.2. Выделение растительной ДНК
2.3. Амплификация фрагментов генов CLE
2.4. Трансформация растений с помощью A. rhizogenes
2.5. Выделение РНК и обратная транскрипция
2.6. Проведение ПЦР в реальном времени
2.7. Биоинформатический анализ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Филогенетический анализ генов CLE
3.2. Распределение генов MtCLE по хромосомам
3.3. Оценка экспрессии генов MtCLE с помощью доступных транскриптомных данных
3.4. Оценка полиморфизма генов MtCLEлюцерны
3.5. Определение последовательностей фрагментов гена MtCLE34 с помощью секвенирования
3.6. Определение влияния отбора в участках генов MtCLE
3.7. Поиск ассоциаций полиморфизма генов MtCLE с количеством образующихся клубеньков
3.8. Изучение функциональной значимости гена MtCLE34 в регуляции развития симбиотических клубеньков у M. truncatula
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ
БЛАГОДАРНОСТИ
Одними из наиболее изученных пептидных фитогормонов являются пептиды CLE (CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION-RELATED). Пептиды CLE имеют размер около 12-14 аминокислот, и образуются из более протяженных белков-предшественников, которые содержат высоко консервативный С-концевой СLE-домен, основная представляющий собой функциональную часть пептидов CLE, а также предполагаемый сигнал секреции на N-конце. Пептиды CLEучаствуют в регуляции различных аспектов развития растений, в том числе̶ в системном контроле развития симбиотических клубеньков. Клубеньки формируются на корнях бобовых растений при симбиозе с почвенными азотфиксирующими бактериями ризобиями. Наряду с механизмами локального контроля, активируемых в результате рецепции сигнальных молекул ризобий,Nod-факторов, в процесс формирования клубеньков у бобовых растений также вовлечены и системные механизмы - система авторегуляции клубенькообразования (Autoregulation Of Nodulation, AON). Ключевым компонентом AON является рецепторная CLAVATA1 (CLV1) - подобная киназа, демонстрирующая высокий процент сходства по последовательности с киназойCLV1, ответственной за поддержание пула стволовых клеток в апикальной меристеме побега. Мутанты по генам, кодирующим CLV1-подобные рецепторы получены у ряда бобовых и все они образуют избыточное число клубеньков при симбиозе с ризобиями (суперклубенькообразующий фенотип). CLV1-подобныекиназы, как было показано с помощью прививок, функционируют в побеге, и их лигандами являются регуляторные пептиды CLE, которые синтезируются в корнях и поступают по проводящей системе из корней – в побег. Однако, в работе системы авторегуляции клубенькообразованияу бобовых растений еще многое остается неизученным. В частности, до конца неясно, какое число пептидов CLE и их рецепторов в ней задействовано.
В настоящей работе проводилось изучение полиморфизма Medicago truncatula по генам, кодирующим пептидыCLE, для которых показано или предполагается участие в системе авторегуляции клубенькообразования. В качестве объектов исследования были использованы 2 линии бобового растения M. truncatula – A17 и R108. В качестве генов для исследования были выбраны гены MtCLE12иMtCLE13, для которых ранее было показано участие в AON (Mortieretal., 2010), а также два родственных им гена, MtCLE34 и MtCLE35. Как было недавно показано в нашей лаборатории, ген MtCLE35 также задействован в AON и сверхэкспрессия этого гена подавляет развитие симбиотических клубеньков. Функция MtCLE34 оставалась неизученной. В открытой рамке считывания гена MtCLE34 у линии люцерны A17 содержится стоп-кодон, что должно приводить к синтезу укороченного нефункционального белка. Однако, у другой лабораторной линии M. truncatula, R108, согласно последовательностям, представленным в базе данных, стоп-кодон отсутствует, таким образом, у линии R108 ген MtCLE34 может кодировать функциональный продукт. Изучение генетического полиморфизма генов MtCLE у бобового растения M. truncatula представляется весьма важным как для фундаментальной науки, так и, в будущем, для прикладных аспектов – селекционной работы и современной практики растениеводства.
Таким образом, целью работы является изучение полиморфизма генов CLE, регулирующих развитие клубеньков у M. truncatula.
В работе были поставлены следующие задачи:
1) Характеристика генов CLEM. truncatula: филогенетический анализ, оценка их расположения на хромосомах люцерны, оценка уровней экспрессии генов CLEс помощью доступных баз данных, поиск консервативных элементов в регуляторных последовательностях генов CLE;
2) Поиск вариабельных позиций в последовательностях генов CLE у линий M. truncatula, доступных в базе данных HapMap и оценка давления отбора нагеныCLE с помощью методов молекулярной эволюции;
3) Изучение функции гена MtCLE34в регуляции развития симбиотических клубеньков у M. truncatula.
В настоящей работе проводилось изучение полиморфизма Medicago truncatula по генам, кодирующим пептидыCLE, для которых показано или предполагается участие в системе авторегуляции клубенькообразования. В качестве объектов исследования были использованы 2 линии бобового растения M. truncatula – A17 и R108. В качестве генов для исследования были выбраны гены MtCLE12иMtCLE13, для которых ранее было показано участие в AON (Mortieretal., 2010), а также два родственных им гена, MtCLE34 и MtCLE35. Как было недавно показано в нашей лаборатории, ген MtCLE35 также задействован в AON и сверхэкспрессия этого гена подавляет развитие симбиотических клубеньков. Функция MtCLE34 оставалась неизученной. В открытой рамке считывания гена MtCLE34 у линии люцерны A17 содержится стоп-кодон, что должно приводить к синтезу укороченного нефункционального белка. Однако, у другой лабораторной линии M. truncatula, R108, согласно последовательностям, представленным в базе данных, стоп-кодон отсутствует, таким образом, у линии R108 ген MtCLE34 может кодировать функциональный продукт. Изучение генетического полиморфизма генов MtCLE у бобового растения M. truncatula представляется весьма важным как для фундаментальной науки, так и, в будущем, для прикладных аспектов – селекционной работы и современной практики растениеводства.
Таким образом, целью работы является изучение полиморфизма генов CLE, регулирующих развитие клубеньков у M. truncatula.
В работе были поставлены следующие задачи:
1) Характеристика генов CLEM. truncatula: филогенетический анализ, оценка их расположения на хромосомах люцерны, оценка уровней экспрессии генов CLEс помощью доступных баз данных, поиск консервативных элементов в регуляторных последовательностях генов CLE;
2) Поиск вариабельных позиций в последовательностях генов CLE у линий M. truncatula, доступных в базе данных HapMap и оценка давления отбора нагеныCLE с помощью методов молекулярной эволюции;
3) Изучение функции гена MtCLE34в регуляции развития симбиотических клубеньков у M. truncatula.
Таким образом, в настоящей работе проводилось изучение полиморфизма Medicago truncatula по генам, кодирующим пептидыCLE–охарактеризованные и потенциальные участники авторегуляции клубенькообразования. В качестве объектов исследования были использованы 2 линии бобового растения M. truncatula – A17 и R108. Для исследования полиморфизма были выбраны следующие гены: гомологи MtCLE12 и MtCLE13 - функционально характеризованные гены, для которых ранее было показано участие в AON; MtCLE35, функция в клубенькообразовании для которого была показана совсем недавно и ген MtCLE34,– роль которого в клубенькообразовании оставалась неизученной. Гены MtCLE12 и MtCLE13 расположены рядом на хромосоме4, тогда как гены MtCLE34 иMtCLE35занимают соседние позиции на хромосоме 2. При этом расположенные рядом пары генов CLEдемонстрируют схожий паттерн экспрессии: экспрессия генов MtCLE12 и MtCLE13 активируется при инокуляции ризобиями и в целом специфична для клубеньков, тогда как расположенные рядом гены MtCLE34 иMtCLE35активируются при клубенькообразовании, при действии нитрата, а также их экспрессия наблюдается в корневой системе неинокулированных растений. Характер экспрессии генов MtCLE34 иMtCLE35позволяет предположить, что их роль в растениях может быть более широкой и может не ограничиваться регуляцией клубенькообразования.
В результате проведенного поиска вариабельных позиций в последовательностях генов CLE у линий M. truncatula, доступных в базе данных HapMap,были обнаружены существующие SNP, из которых в гене MtCLE13 – только две синонимичные замены, что может свидетельствовать о консервативности этого гена и значимости его функций для жизни растения, а также о возможном существовании направленного отбора в эволюции. У генов MtCLE12, MtCLE34 и MtCLE35 - синонимичные и несинонимичные замены. При этом в гене MtCLE35 было выявлено наибольшее количество SNP и значения D-критерия для него составляет -0,35, самое приближенное к нулю значение, по сравнению с остальными генами, а также 2 несинонимичных на 3 синонимичные замены. Среди проанализированных «клубеньковых» генов люцерны, ген MtCLE35 по всем показателям более вариабельный по сравнению с другими изученными генами CLE.
Выявление стоп-кодона в гене MtCLE34у лабораторной линии A17, а также у трех других линий из 262 линий, данные oSNPдля которых представлены в базе HapMap,свидетельствует в пользу того, что функция этого гена не является жизненно важной для растений. Проведенная трансформация линии A17 растения M. truncatula с целью оценки эффекта сверхэкспрессии функционального гена MtCLE34, полученного от линии R108, на клубенькообразование показала, что сверхэкспрессия гена MtCLE34 не оказывает эффекта на количество образующихся клубеньков, что отличает этот ген от родственных ему «клубеньковых» генов MtCLE13, MtCLE12 и MtCLE35 – ингибиторов клубенькообразования. Таким образом, пептид MtCLE34, во-видимому, не является участникомAON.Представляет особый интерес осуществить с помощью экспериментальных подходов поиск возможных причин того, почему в ходе эволюции этот близкий гомологиндуцируемых нитратом генов CLEсои утратил способность подавлять развитие симбиотических клубеньков у люцерны.
В результате проведенного поиска вариабельных позиций в последовательностях генов CLE у линий M. truncatula, доступных в базе данных HapMap,были обнаружены существующие SNP, из которых в гене MtCLE13 – только две синонимичные замены, что может свидетельствовать о консервативности этого гена и значимости его функций для жизни растения, а также о возможном существовании направленного отбора в эволюции. У генов MtCLE12, MtCLE34 и MtCLE35 - синонимичные и несинонимичные замены. При этом в гене MtCLE35 было выявлено наибольшее количество SNP и значения D-критерия для него составляет -0,35, самое приближенное к нулю значение, по сравнению с остальными генами, а также 2 несинонимичных на 3 синонимичные замены. Среди проанализированных «клубеньковых» генов люцерны, ген MtCLE35 по всем показателям более вариабельный по сравнению с другими изученными генами CLE.
Выявление стоп-кодона в гене MtCLE34у лабораторной линии A17, а также у трех других линий из 262 линий, данные oSNPдля которых представлены в базе HapMap,свидетельствует в пользу того, что функция этого гена не является жизненно важной для растений. Проведенная трансформация линии A17 растения M. truncatula с целью оценки эффекта сверхэкспрессии функционального гена MtCLE34, полученного от линии R108, на клубенькообразование показала, что сверхэкспрессия гена MtCLE34 не оказывает эффекта на количество образующихся клубеньков, что отличает этот ген от родственных ему «клубеньковых» генов MtCLE13, MtCLE12 и MtCLE35 – ингибиторов клубенькообразования. Таким образом, пептид MtCLE34, во-видимому, не является участникомAON.Представляет особый интерес осуществить с помощью экспериментальных подходов поиск возможных причин того, почему в ходе эволюции этот близкий гомологиндуцируемых нитратом генов CLEсои утратил способность подавлять развитие симбиотических клубеньков у люцерны.