Разработка, синтез и анализ антибиотической активности структурных модификаций пептидов семейства кателицидинов
|
Обозначения и сокращения 4
1 Введение 5
Актуальность 5
Цели и задачи 7
2. Обзор литературы 8
2.1 Врожденный и приобретенный иммунитет 8
2.2 Морфо-биохимические и функциональные особенности нейтрофильных гранулоцитов 9
2.2.1 Гранулярный аппарат нейтрофилов 10
2.2.2 Нейтрофильные внеклеточные ловушки 12
2.2.3. Кислородзависимая и кислороднезависимая антимикробные системы нейтрофилов 13
2.3 Антимикробные пептиды. Общая информация 14
2.3.1 История открытия 14
2.3.2 Механизм действия АМП 14
2.3.2.1 Взаимодействие АМП с клеточными мембранами 15
2.3.3. Другие биологические эффекты АМП 17
2.3.4 Классификация антимикробных пептидов 18
2.3.4.1 Дефенсины 18
2.3.4.2 Кателицидины 19
2.3.4.3 Гистатины 21
2.4 Антибиотики, применяемые в медицине 22
2.4.1 Класс бета-лактамных антибиотиков. Оксациллин 22
2.4.2 Класс аминогликозиды. Амикацин 24
2.4.3 Класс Фторхинолоны. Офлоксацин 25
2.5 Протегрин-1 27
2.5.1 Протегрин. Активность 28
2.5.2 Эффективность 28
3 Материалы и методы исследования 30
3.1 Материалы 30
3.2 Твердофазный синтез по Меррифилду 31
3.2 Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография 31
3.3 Аналитический электрофорез в кислой буферной системе в присутствии мочевины 32
3.3 Определение концентрации белка в пробе спектрофотометрическим методом с использованием коэффициента молярной экстинции (е) 32
3.4 Конъюгация протегрина с амикацином 33
3.4.1 Конъюгация с использованием кросслинкера DSP 33
3.4.2 Конъюгация с использованием сукцинового ангидрида и этилдиметиламинопропилкарбодиимида в качестве кросслинкера 33
3.5 Оценка антимикробной активности исследуемых препаратов (антимикробных пептидов, антибиотических соединений) 34
3.5.1 Метод серийных разведений в жидкой питательной среде, содержащей микроорганизмы 34
3.5.2. Оценка совместного микробоцидного действия исследуемых антимикробных пептидов и антибиотических соединений методом серийных разведений по принципу "шахматной доски" 36
3.6 Анализ гемолитической активности препаратов 38
4. Результаты 39
4.1 Твердофазный синтез структурного аналога протегрина 1 39
4.2 Очистка и оценка чистоты полученного пептида 41
4.3 Оценка антимикробной активности структурных аналогов протегрина 1 44
4.4 Исследование активности протегрина 1 и различных антибиотических соединений в отношении бактерий 45
4.4.1 Изучение антибактериальной активности индивидуальных фракций различных антибиотиков (амикацина, офлоксацина, оксациллина), а также протегрина 1 в отношении различных бактерий 45
4.4.2 Изучение совместного антибактериального действия протегрина 1 и различных антибиотических соединений (амикацина, офлоксацина, оксациллина) 47
4.5 Изучение антимикробного действия конъюгатов протегрина с амикацином 49
4.5.1 Получение конъюгатов протегрина 1 с амикацином 49
4.5.2 Изучение активности полученных конъюгатов против различных бактерий 51
4.6 Оценка гемолитической активности структурных аналогов протегрина 1 и его конъюгата с амикацином в отношении эритроцитов человека 52
5 Обсуждение результатов 53
6 Заключение 56
7 Выводы 57
8 Список литературы 58
1 Введение 5
Актуальность 5
Цели и задачи 7
2. Обзор литературы 8
2.1 Врожденный и приобретенный иммунитет 8
2.2 Морфо-биохимические и функциональные особенности нейтрофильных гранулоцитов 9
2.2.1 Гранулярный аппарат нейтрофилов 10
2.2.2 Нейтрофильные внеклеточные ловушки 12
2.2.3. Кислородзависимая и кислороднезависимая антимикробные системы нейтрофилов 13
2.3 Антимикробные пептиды. Общая информация 14
2.3.1 История открытия 14
2.3.2 Механизм действия АМП 14
2.3.2.1 Взаимодействие АМП с клеточными мембранами 15
2.3.3. Другие биологические эффекты АМП 17
2.3.4 Классификация антимикробных пептидов 18
2.3.4.1 Дефенсины 18
2.3.4.2 Кателицидины 19
2.3.4.3 Гистатины 21
2.4 Антибиотики, применяемые в медицине 22
2.4.1 Класс бета-лактамных антибиотиков. Оксациллин 22
2.4.2 Класс аминогликозиды. Амикацин 24
2.4.3 Класс Фторхинолоны. Офлоксацин 25
2.5 Протегрин-1 27
2.5.1 Протегрин. Активность 28
2.5.2 Эффективность 28
3 Материалы и методы исследования 30
3.1 Материалы 30
3.2 Твердофазный синтез по Меррифилду 31
3.2 Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография 31
3.3 Аналитический электрофорез в кислой буферной системе в присутствии мочевины 32
3.3 Определение концентрации белка в пробе спектрофотометрическим методом с использованием коэффициента молярной экстинции (е) 32
3.4 Конъюгация протегрина с амикацином 33
3.4.1 Конъюгация с использованием кросслинкера DSP 33
3.4.2 Конъюгация с использованием сукцинового ангидрида и этилдиметиламинопропилкарбодиимида в качестве кросслинкера 33
3.5 Оценка антимикробной активности исследуемых препаратов (антимикробных пептидов, антибиотических соединений) 34
3.5.1 Метод серийных разведений в жидкой питательной среде, содержащей микроорганизмы 34
3.5.2. Оценка совместного микробоцидного действия исследуемых антимикробных пептидов и антибиотических соединений методом серийных разведений по принципу "шахматной доски" 36
3.6 Анализ гемолитической активности препаратов 38
4. Результаты 39
4.1 Твердофазный синтез структурного аналога протегрина 1 39
4.2 Очистка и оценка чистоты полученного пептида 41
4.3 Оценка антимикробной активности структурных аналогов протегрина 1 44
4.4 Исследование активности протегрина 1 и различных антибиотических соединений в отношении бактерий 45
4.4.1 Изучение антибактериальной активности индивидуальных фракций различных антибиотиков (амикацина, офлоксацина, оксациллина), а также протегрина 1 в отношении различных бактерий 45
4.4.2 Изучение совместного антибактериального действия протегрина 1 и различных антибиотических соединений (амикацина, офлоксацина, оксациллина) 47
4.5 Изучение антимикробного действия конъюгатов протегрина с амикацином 49
4.5.1 Получение конъюгатов протегрина 1 с амикацином 49
4.5.2 Изучение активности полученных конъюгатов против различных бактерий 51
4.6 Оценка гемолитической активности структурных аналогов протегрина 1 и его конъюгата с амикацином в отношении эритроцитов человека 52
5 Обсуждение результатов 53
6 Заключение 56
7 Выводы 57
8 Список литературы 58
Актуальность
В 1928 г. британский бактериолог Александр Флеминг выделил пенициллин из плесневых грибов Penicillium rubens. Со времен этого открытия фармацевтами были созданы тысячи различных антибиотиков. Многолетняя ожесточенная борьба с патогенными микроорганизмами привела к появлению множества устойчивых к антибиотикам форм бактерий. Оказалось, что почти все бактерии со временем способны стать резистентными к практически любым антибиотикам [1]. Принципиально новым классом природных антибиотиков являются антимикробные пептиды (АМП) - олигопептиды (20-40 аминокислотных остатков, в среднем), задействованные в системе врожденного иммунитета и способные уничтожать патогенные микроорганизмы.
Известно, что система врожденного иммунитета принимает участие во многих процессах, направленных на адаптацию организма к различным неблагоприятным условиям, что привлекает все больше внимания к ее изучению [2-9]. Антимикробные пептиды, которые содержатся в основном в лизосомоподобных гранулах нейтрофилов, являются одними из ключевых эффекторных молекул системы врожденного иммунитета. Показано, что за исключением антимикробной активности, АМП обладают более широким спектром биологической активности, например:
• стимулируют хемотаксис макрофагов, нейтрофилов, незрелых дендритных клеток [10,11];
• связывают бактериальные липополисахариды [12];
• влияют на процессинг ИЛ-1 [13];
• влияют на функциональную активность и метаболизм тромбоцитов [14];
АМП имеют множественные мишени в бактериальных клетках, большинство пептидов, в первую очередь, нарушает структурную целостность мембран бактерий, поэтому гибель бактерий осуществляется в короткие сроки, и выработка резистентности значительно менее вероятна, чем в случае применяемых в клинике антибиотиков. Для многих АМП доказано эффективное антимикробное действие в отношении мультирезистентных штаммов бактерий. Это все позволяет рассматривать АМП как перспективную основу для создания новых лекарственных препаратов с антибиотической и иммуномодулирующей активностью, которые могут оказаться хорошей альтернативой существующим антибиотикам.
Однако препятствием для немедленного внедрения препаратов на основе АМП в медицину является то обстоятельство, что у наиболее активных пептидов имеется некотороя токсичность для клеток макроорганизма. Поэтому используются разнообразные подходы к изменению свойств пептидов для снижения их токсичности.
Одним из наиболее активных в отношении широкого спектра бактерий пептидом является протегрин 1 - пептид семейства кателицидинов, лейкоцитов свиньи, имеющий конформацию бета-шпильки. Этот пептид был первые выделен из лейкоцитов в ходе совместной работы сотрудников Института экспериментальной медицины и лаборатории профессора Роберта Лерера Калифорнийского университета Лос-Анджелеса. Наличие высокой антибактериальной активности позволяет рассматривать протегрин 1 в качестве перспективного прототипа антибиотического препарата для борьбы с инфекциями, вызываемыми антибиотико-резистентными бактериями. Как и в случае многих эффективных АМП протегрин 1 имеет нежелательные эффекты - проявляет некоторую гемолитическую активность в отношении клеток человека. Поэтому для создания на основе протегрина 1 медицинского препарата, безопасного для применения в клинике, необходимо найти пути для оптимизации свойств пептида.
Цели и задачи
Целью ВКР является поиск подходов к созданию прототипов новых антибиотиков на основе протегрина-1.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
• Твердофазный химический синтез и очистка пептида - аналога PG-1;
• Сравнительный анализ антимикробной активности структурных аналогов PG-1 и их гемолитического действия на эритроциты человека in vitro;
• Анализ совместного действия PG-1 и применяемых в клинике антибиотиков в отношении антибиотико-резистентных бактерий;
• Конъюгация PG-1 с антибиотиком, в комбинации с которым наблюдалось синергическое антимикробное действие;
• Оценка антимикробной активности полученных конъюгатов и их гемолитических свойств.
В результате проведенной работы будут получены новые данные, способствующие разработке эффективного антибиотика на основе АМП семейства кателицидинов - протегрина 1.
В 1928 г. британский бактериолог Александр Флеминг выделил пенициллин из плесневых грибов Penicillium rubens. Со времен этого открытия фармацевтами были созданы тысячи различных антибиотиков. Многолетняя ожесточенная борьба с патогенными микроорганизмами привела к появлению множества устойчивых к антибиотикам форм бактерий. Оказалось, что почти все бактерии со временем способны стать резистентными к практически любым антибиотикам [1]. Принципиально новым классом природных антибиотиков являются антимикробные пептиды (АМП) - олигопептиды (20-40 аминокислотных остатков, в среднем), задействованные в системе врожденного иммунитета и способные уничтожать патогенные микроорганизмы.
Известно, что система врожденного иммунитета принимает участие во многих процессах, направленных на адаптацию организма к различным неблагоприятным условиям, что привлекает все больше внимания к ее изучению [2-9]. Антимикробные пептиды, которые содержатся в основном в лизосомоподобных гранулах нейтрофилов, являются одними из ключевых эффекторных молекул системы врожденного иммунитета. Показано, что за исключением антимикробной активности, АМП обладают более широким спектром биологической активности, например:
• стимулируют хемотаксис макрофагов, нейтрофилов, незрелых дендритных клеток [10,11];
• связывают бактериальные липополисахариды [12];
• влияют на процессинг ИЛ-1 [13];
• влияют на функциональную активность и метаболизм тромбоцитов [14];
АМП имеют множественные мишени в бактериальных клетках, большинство пептидов, в первую очередь, нарушает структурную целостность мембран бактерий, поэтому гибель бактерий осуществляется в короткие сроки, и выработка резистентности значительно менее вероятна, чем в случае применяемых в клинике антибиотиков. Для многих АМП доказано эффективное антимикробное действие в отношении мультирезистентных штаммов бактерий. Это все позволяет рассматривать АМП как перспективную основу для создания новых лекарственных препаратов с антибиотической и иммуномодулирующей активностью, которые могут оказаться хорошей альтернативой существующим антибиотикам.
Однако препятствием для немедленного внедрения препаратов на основе АМП в медицину является то обстоятельство, что у наиболее активных пептидов имеется некотороя токсичность для клеток макроорганизма. Поэтому используются разнообразные подходы к изменению свойств пептидов для снижения их токсичности.
Одним из наиболее активных в отношении широкого спектра бактерий пептидом является протегрин 1 - пептид семейства кателицидинов, лейкоцитов свиньи, имеющий конформацию бета-шпильки. Этот пептид был первые выделен из лейкоцитов в ходе совместной работы сотрудников Института экспериментальной медицины и лаборатории профессора Роберта Лерера Калифорнийского университета Лос-Анджелеса. Наличие высокой антибактериальной активности позволяет рассматривать протегрин 1 в качестве перспективного прототипа антибиотического препарата для борьбы с инфекциями, вызываемыми антибиотико-резистентными бактериями. Как и в случае многих эффективных АМП протегрин 1 имеет нежелательные эффекты - проявляет некоторую гемолитическую активность в отношении клеток человека. Поэтому для создания на основе протегрина 1 медицинского препарата, безопасного для применения в клинике, необходимо найти пути для оптимизации свойств пептида.
Цели и задачи
Целью ВКР является поиск подходов к созданию прототипов новых антибиотиков на основе протегрина-1.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
• Твердофазный химический синтез и очистка пептида - аналога PG-1;
• Сравнительный анализ антимикробной активности структурных аналогов PG-1 и их гемолитического действия на эритроциты человека in vitro;
• Анализ совместного действия PG-1 и применяемых в клинике антибиотиков в отношении антибиотико-резистентных бактерий;
• Конъюгация PG-1 с антибиотиком, в комбинации с которым наблюдалось синергическое антимикробное действие;
• Оценка антимикробной активности полученных конъюгатов и их гемолитических свойств.
В результате проведенной работы будут получены новые данные, способствующие разработке эффективного антибиотика на основе АМП семейства кателицидинов - протегрина 1.
В результате проведенной работы получены новые данные о структурно-функциональных свойствах синтетических аналогов природного антимикробного пептида семейства кателицидинов - протегрина 1, отобран наиболее перспективный с точки зрения практического применения аналог. Последующий детальный анализ спектра и механизма антимикробной активности этого пептида позволит разработать на его основе антибиотические препараты. Получена новая информация, подтверждающая целесообразность использования антимикробных пептидов животного происхождения в комбинации с применяемыми в медицине антибиотиками, а именно - использования комбинации протегрино-подобных пептидов и аминогликозидов. Полученные данные будут способствовать дальнейшим шагам в создании новых средств для терапии инфекционных заболеваний, которые вызываются бактериями, резистентными к конвенциональным антибиотикам, в частности средств для местного применения, используемых при обработке инфицированных ран, покрытии катетеров, стентов и других медицинских материалов.
