Характеристика комплекса антимикробного пептида тахиплезина с белком С1q
|
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Врождённый иммунный ответ
1.2 Система комплемента
1.2.1 Классический путь активации комплемента
1.2.2 Альтернативный путь активации комплемента
1.2.3 Лектиновый путь активации комплемента
1.2.4 Ингибиторы комплемента
1.2.5 Функции системы комплемента
1.2.6 Заболевания, связанные с системой комплемента.
1.2.7 Терапия заболеваний, связанных с комплементом
1.3 Белок C1q – паттерн-распознающая молекула классического пути каскада комплемента
1.3.1 Строение С1q
1.3.2 Некоторые лиганды С1q
1.3.3 Функции С1q, не связанные с активацией комплемента
1.4 Антимикробные пептиды
1.4.1 АМП как регуляторы системы комплемента
1.4.2 Тахиплезины
ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Получение C1q
2.1.1 Осаждение белков из сыворотки для выделения С1q
2.1.1.1. Осаждение белков из сыворотки полиэтиленгликолем
2.1.1.2. Осаждение белков из сыворотки при уменьшении ионной силы сыворотки
2.1.2 Аффинная хроматография.
2.1.2.1. Подготовка колонки для аффинной хроматографии.
2.1.2.2. Проведение аффинной хроматографии
2.1.3 Ионообменная хроматография
2.1.3.1 Подготовка колонки для ионообменной хроматографии
2.1.3.2 Проведение ионообменной хроматографии
2.1.4 Концентрирование препарата С1q
2.1.5 Анализ полученных образцов с помощью SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ)
2.2. Оценка стехиометрии взаимодействия С1q с тахиплезином-1 методом жидкофазной протонной ЯМР-спектроскопии.
2.3. Оценка стехиометрии взаимодействия С1q с тахиплезином-1 методом последовательных разведений преципитата
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Получение С1q
3.2. Оценка стехиометрии взаимодействия С1q с тахиплезином-1 методом жидкофазной протонной ЯМР-спектроскопии.
3.3. Оценка стехиометрии взаимодействия С1q с тахиплезином-1 методом последовательных разведений преципитата
3.4 Исследование преципитата комплекса С1q и ТР-1 методом атомной силовой микроскопии
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Врождённый иммунный ответ
1.2 Система комплемента
1.2.1 Классический путь активации комплемента
1.2.2 Альтернативный путь активации комплемента
1.2.3 Лектиновый путь активации комплемента
1.2.4 Ингибиторы комплемента
1.2.5 Функции системы комплемента
1.2.6 Заболевания, связанные с системой комплемента.
1.2.7 Терапия заболеваний, связанных с комплементом
1.3 Белок C1q – паттерн-распознающая молекула классического пути каскада комплемента
1.3.1 Строение С1q
1.3.2 Некоторые лиганды С1q
1.3.3 Функции С1q, не связанные с активацией комплемента
1.4 Антимикробные пептиды
1.4.1 АМП как регуляторы системы комплемента
1.4.2 Тахиплезины
ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Получение C1q
2.1.1 Осаждение белков из сыворотки для выделения С1q
2.1.1.1. Осаждение белков из сыворотки полиэтиленгликолем
2.1.1.2. Осаждение белков из сыворотки при уменьшении ионной силы сыворотки
2.1.2 Аффинная хроматография.
2.1.2.1. Подготовка колонки для аффинной хроматографии.
2.1.2.2. Проведение аффинной хроматографии
2.1.3 Ионообменная хроматография
2.1.3.1 Подготовка колонки для ионообменной хроматографии
2.1.3.2 Проведение ионообменной хроматографии
2.1.4 Концентрирование препарата С1q
2.1.5 Анализ полученных образцов с помощью SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ)
2.2. Оценка стехиометрии взаимодействия С1q с тахиплезином-1 методом жидкофазной протонной ЯМР-спектроскопии.
2.3. Оценка стехиометрии взаимодействия С1q с тахиплезином-1 методом последовательных разведений преципитата
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Получение С1q
3.2. Оценка стехиометрии взаимодействия С1q с тахиплезином-1 методом жидкофазной протонной ЯМР-спектроскопии.
3.3. Оценка стехиометрии взаимодействия С1q с тахиплезином-1 методом последовательных разведений преципитата
3.4 Исследование преципитата комплекса С1q и ТР-1 методом атомной силовой микроскопии
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Исследование молекулярных механизмов реализации функций врождённого иммунитета привлекает всё больше внимания, поскольку он не только обеспечивает неотложный ответ организма на вторжение патогенных микроорганизмов, но и участвует во многих жизненно важных физиологических процессах, направленных на поддержание гомеостаза, адаптацию организма к различным неблагоприятным воздействиям, координацию различных систем в ходе иммунного ответа [1]. Одной из основных систем врождённого иммунитета является система комплемента – древняя протеолитическая система, играющая важную роль в распознавании патогенов и быстром иммунном ответе на инфекцию, развитии воспалительной реакции, фагоцитозе апоптотических клеток, а также выступающая связующим звеном между врождённым и приобретённым иммунным ответом.
Сравнительно большое число компонентов комплемента (более 30 белков) и клеток организма, которые синтезируют компоненты комплемента и/или имеют рецепторы к ним, отражает широкий спектр функций, выполняемых системой комплемента, и масштаб воздействия этой системы на организм в целом. Так как механизм действия комплемента представляет собой каскад протеолитических реакций, нарушения работы системы комплемента на любом уровне приводят к серьёзным последствиям для организма, в том числе и к таким заболеваниям, как атипичный гемолитико-уремический синдром, С3 гломерулопатии, возрастная макулодистрофия, пароксизмальная ночная гемоглубинурия, системная красная волчанка [2–4]. Активация комплемента является причиной развития осложнений при аутоиммунной гемолитической анемии, болезни Альцгеймера и возрастных нейродегенеративных процессах, сепсисе, ишемии/реперфузии тканей. Не до конца ясна роль комплемента в процессе образования и роста опухолей: при различных видах рака действие разных компонентов комплемента на опухоли варьирует [5].
Для облегчения течения и лечения вышеописанных заболеваний современной медицине требуются как препараты, способные ингибировать комплемент, так и препараты, активирующие систему комплемента. На данный момент создано 2 лекарственных препарата, представляющих собой ингибиторы комплемента (рекомбинантный С1Inh и антитела к С5)[2]. Однако стоимость этих препаратов очень высока (одни из самых дорогих лекарственных препаратов в мире), тогда как при большинстве нарушений работы комплемента требуется постоянное медикаментозное лечение.
Показано, что в качестве регуляторов активации комплемента могут выступать антимикробные пептиды (АМП), для которых характерно доминирование β-структуры, стабилизированной дисульфидными связями. В частности, такие АМП, как протегрин-1, тахиплезин-1, ареницин-1 взаимодействуют с паттерн-распознающей молекулой классического пути каскада комплемента С1q и оказывают дозозависимое влияние на активацию комплемента [6]. В литературе также встречаются противоречивые данные об активации и ингибировании комплемента по классическому пути дефенсинами за счёт взаимодействия с молекулой С1q[7-9]. В этих исследованиях содержатся косвенные свидетельства, указывающие на возможность множественного связывания дефенсинов с С1q, что, вероятно, является причиной затруднений при анализе такого взаимодействия традиционными методами [6]. Продукция АМП в клетках Escherichiacoli (рекомбинантные АМП) или с помощью пептидного синтезатора (синтетические АМП) имеет более низкую себестоимость, чем продукция белков, требующих посттрансляционных модификаций (таких как С1Inh, антитела), которая возможна только в клетках млекопитающих. Кроме того, существует возможность на основе имеющихся данных разработать и синтезировать АМП, не встречающиеся в природе, но имеющие оптимальный терапевтический эффект. Таким образом, АМП представляются перспективными прототипами для создания препаратов, модулирующих работу комплемента.
На сегодняшний день в литературе существует не так много данных о влиянии АМП на активацию/ингибирование системы комплемента, необходимых для разработки лекарственных препаратов на их основе. Изучение взаимодействия β-структурных АМП с паттерн-распознающими молекулами системы комплемента, инициирующими её активацию, представляется первостепенной задачей. В качестве модели такого взаимодействия был получен комплекс паттерн-распознающей молекулы классического пути активации комплемента С1q и β-шпилечного АМП тахиплезина-1.
Цель данной выпускной квалификационной работы: изучение взаимодействия паттерн-распознающей молекулы классического пути каскада комплемента С1q с антимикробным пептидом тахиплезином-1 invitro.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1) оптимизировать метод выделения С1q из сыворотки крови человека;
2) оценить стехиометрию взаимодействия С1q с тахиплезином-1 методом жидкофазной протонной ЯМР-спектроскопии;
3) оценить стехиометрию взаимодействия С1q с тахиплезином-1 с помощью метода последовательных разведений и электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях в присутствии.
Сравнительно большое число компонентов комплемента (более 30 белков) и клеток организма, которые синтезируют компоненты комплемента и/или имеют рецепторы к ним, отражает широкий спектр функций, выполняемых системой комплемента, и масштаб воздействия этой системы на организм в целом. Так как механизм действия комплемента представляет собой каскад протеолитических реакций, нарушения работы системы комплемента на любом уровне приводят к серьёзным последствиям для организма, в том числе и к таким заболеваниям, как атипичный гемолитико-уремический синдром, С3 гломерулопатии, возрастная макулодистрофия, пароксизмальная ночная гемоглубинурия, системная красная волчанка [2–4]. Активация комплемента является причиной развития осложнений при аутоиммунной гемолитической анемии, болезни Альцгеймера и возрастных нейродегенеративных процессах, сепсисе, ишемии/реперфузии тканей. Не до конца ясна роль комплемента в процессе образования и роста опухолей: при различных видах рака действие разных компонентов комплемента на опухоли варьирует [5].
Для облегчения течения и лечения вышеописанных заболеваний современной медицине требуются как препараты, способные ингибировать комплемент, так и препараты, активирующие систему комплемента. На данный момент создано 2 лекарственных препарата, представляющих собой ингибиторы комплемента (рекомбинантный С1Inh и антитела к С5)[2]. Однако стоимость этих препаратов очень высока (одни из самых дорогих лекарственных препаратов в мире), тогда как при большинстве нарушений работы комплемента требуется постоянное медикаментозное лечение.
Показано, что в качестве регуляторов активации комплемента могут выступать антимикробные пептиды (АМП), для которых характерно доминирование β-структуры, стабилизированной дисульфидными связями. В частности, такие АМП, как протегрин-1, тахиплезин-1, ареницин-1 взаимодействуют с паттерн-распознающей молекулой классического пути каскада комплемента С1q и оказывают дозозависимое влияние на активацию комплемента [6]. В литературе также встречаются противоречивые данные об активации и ингибировании комплемента по классическому пути дефенсинами за счёт взаимодействия с молекулой С1q[7-9]. В этих исследованиях содержатся косвенные свидетельства, указывающие на возможность множественного связывания дефенсинов с С1q, что, вероятно, является причиной затруднений при анализе такого взаимодействия традиционными методами [6]. Продукция АМП в клетках Escherichiacoli (рекомбинантные АМП) или с помощью пептидного синтезатора (синтетические АМП) имеет более низкую себестоимость, чем продукция белков, требующих посттрансляционных модификаций (таких как С1Inh, антитела), которая возможна только в клетках млекопитающих. Кроме того, существует возможность на основе имеющихся данных разработать и синтезировать АМП, не встречающиеся в природе, но имеющие оптимальный терапевтический эффект. Таким образом, АМП представляются перспективными прототипами для создания препаратов, модулирующих работу комплемента.
На сегодняшний день в литературе существует не так много данных о влиянии АМП на активацию/ингибирование системы комплемента, необходимых для разработки лекарственных препаратов на их основе. Изучение взаимодействия β-структурных АМП с паттерн-распознающими молекулами системы комплемента, инициирующими её активацию, представляется первостепенной задачей. В качестве модели такого взаимодействия был получен комплекс паттерн-распознающей молекулы классического пути активации комплемента С1q и β-шпилечного АМП тахиплезина-1.
Цель данной выпускной квалификационной работы: изучение взаимодействия паттерн-распознающей молекулы классического пути каскада комплемента С1q с антимикробным пептидом тахиплезином-1 invitro.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1) оптимизировать метод выделения С1q из сыворотки крови человека;
2) оценить стехиометрию взаимодействия С1q с тахиплезином-1 методом жидкофазной протонной ЯМР-спектроскопии;
3) оценить стехиометрию взаимодействия С1q с тахиплезином-1 с помощью метода последовательных разведений и электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях в присутствии.
Нарушения функционирования системы комплемента являются причиной тяжёлых заболеваний, терапия которых либо очень дорогостоящая, либо до сих пор не разработана. В связи с этим необходимо создать лекарственные препараты, эффективно регулирующие действие комплемента и имеющие низкую себестоимость. В качестве регуляторов комплемента могут выступать АМП, для которых характерно доминирование β-структуры, стабилизированной дисульфидными связями. Продукция АМП в клетках E.coli или с помощью пептидного синтезатора имеет более низкую себестоимость, чем продукция белков, требующих посттрансляционных модификаций (таких как С1Inh, антитела), которая возможна только в клетках млекопитающих. Кроме того, существует возможность разработать и синтезировать АМП, не встречающиеся в природе, но имеющие оптимальный терапевтический эффект.
Моделью для изучения взаимодействия АМП с компонентами комплемента может выступать комплекс ТР-1 и С1q. Белок С1q– паттерн-распознающая молекула, инициирующая активацию комплемента по классическому пути, более того, С1q имеет и ряд функций, не связанных с системой комплемента. Следовательно, С1qможет быть мишенью для лекарственных препаратов. В данной работе методами протонной жидкофазной ЯМР-спектроскопии и электрофореза в денатурирующих условиях в присутствии SDSбыло подтверждено описанное в литературе взаимодействие ТР-1 с С1q (Chen, 2005), а также приводятся данные, позволяющие оценить приблизительную стехиометрию этого взаимодействия. Полученные экспериментальные данные согласуются с имеющимися в литературе косвенными свидетельствами множественного связывания дефенсинов с молекулой C1q. Результаты исследования позволяют предположить, что в последующих экспериментах необходимо учитывать концентрации, при которых молекулы С1q взаимодействуют с АМП. Олигомеризация различных АМП в растворе была описана в литературе (Suresh, 2006, Пантелеев, 2016), тем не менее, соответствующие данные об олигомеризации ТР-1 в растворе отсутствуют. Сложная стехиометрия препятствует количественной оценке взаимодействия традиционными методами, такими как метод поверхностного плазмонного резонанса SPR[6].
В качестве плана для дальнейшего изучения взаимодействия С1q и ТР-1 можно предложить исследовать полученные кристаллоподобные структуры комплекса С1q и ТР-1 методом кристаллографии, а также взаимодействие С1q и ТР-1 при различных концентрациях белка и пептида.
Моделью для изучения взаимодействия АМП с компонентами комплемента может выступать комплекс ТР-1 и С1q. Белок С1q– паттерн-распознающая молекула, инициирующая активацию комплемента по классическому пути, более того, С1q имеет и ряд функций, не связанных с системой комплемента. Следовательно, С1qможет быть мишенью для лекарственных препаратов. В данной работе методами протонной жидкофазной ЯМР-спектроскопии и электрофореза в денатурирующих условиях в присутствии SDSбыло подтверждено описанное в литературе взаимодействие ТР-1 с С1q (Chen, 2005), а также приводятся данные, позволяющие оценить приблизительную стехиометрию этого взаимодействия. Полученные экспериментальные данные согласуются с имеющимися в литературе косвенными свидетельствами множественного связывания дефенсинов с молекулой C1q. Результаты исследования позволяют предположить, что в последующих экспериментах необходимо учитывать концентрации, при которых молекулы С1q взаимодействуют с АМП. Олигомеризация различных АМП в растворе была описана в литературе (Suresh, 2006, Пантелеев, 2016), тем не менее, соответствующие данные об олигомеризации ТР-1 в растворе отсутствуют. Сложная стехиометрия препятствует количественной оценке взаимодействия традиционными методами, такими как метод поверхностного плазмонного резонанса SPR[6].
В качестве плана для дальнейшего изучения взаимодействия С1q и ТР-1 можно предложить исследовать полученные кристаллоподобные структуры комплекса С1q и ТР-1 методом кристаллографии, а также взаимодействие С1q и ТР-1 при различных концентрациях белка и пептида.