Молекулярно-биологические характеристики вакцинного штамма на основе гриппозного вектора, экспрессирующего протективные белки различных фаз жизненного цикла M. tuberculosis
|
Список используемых сокращений 4
1. Введение и актуальность работы 5
2. Обзор литературы 9
2.1. Проблема туберкулёза в мире 9
2.2. Патогенез и жизненный цикл M.tuberculosis 10
2.3. Вакцины-кандидаты и аналоги 12
2.4. Кандидатные белки TB10.4 и HspX 17
2.4.1. Секреторный белок TB10.4 18
2.4.2. Иммуноген из семейства белков теплового шока - HspX 19
2.5. Перспектива создания векторных вакцин мукозального применения на основе аттенуированного вируса гриппа 21
3. Материалы и методы 23
3.1. Культивирование вируса 23
3.2. Клонирование и культивирование вирусов в куриных эмбрионах 24
3.3. Выделение и очистка вирусной РНК из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов и культуральной жидкости 24
3.4. Пробоподготовка и постановка ПЦР с обратной транскрипцией 25
3.5. Электрофорез ДНК в агарозном геле 27
3.6. Определение концентрации белка с помощью флуориметра Qubit 2.0 27
3.7. Электрофорез белков в градиентном полиакриламидном геле 28
3.8. Вестерн-блоттинг и иммунодетекция белков 29
3.9. Масс-спектрометрический анализ MALDI-TOF 29
3.10. Исследование специфической безопасности вакцинного штамма 30
3.10.1. Этические принципы и регулирующие стандарты 30
3.10.2. Выбор вида и количества животных 30
3.10.3. Иммунизация животных и клинические наблюдения 31
3.10.4. Забор органов и подготовка гомогенатов тканей 31
3.10.5. Выявление генетического материала вируса гриппа А в органах методом ПЦР 31
3.10.6. Выделение вируса инфекционного вакцинного штамма из гомогенатов тканей в культуре MDCK 32
3.10.7. Схема исследования 32
3.11. Работа с трёхмерными изображениями и эпитопами 34
4. Результаты работы 35
4.1. Работа с последовательностями, трёхмерными структурами и эпитопами 35
4.2. Изучение генетической стабильности вставки антигенов в гене NS вируса A/PR8/NS124-TB10.4-2A-HspX 37
4.3. Проверка наработки белков рекомбинантными штаммами 42
4.4. Анализ белковых последовательностей с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии 45
4.5. Исследование безопасности вакцинного щтамма на мышах G57/black/6 50
4.5.1. Динамика массы тела и смертности 50
4.5.2. Детекция РНК вакцинного штамма A/PR8/NS124-TB10.4-2A-HspX из респираторного тракта мышей линии G57/black 52
4.5.3. Выделение инфекционного вируса из респираторного тракта мышей линии G57/black в клеточной культуре MDCK 53
5. Обсуждение 55
6. Выводы и заключение 58
7. Список используемой литературы 59
1. Введение и актуальность работы 5
2. Обзор литературы 9
2.1. Проблема туберкулёза в мире 9
2.2. Патогенез и жизненный цикл M.tuberculosis 10
2.3. Вакцины-кандидаты и аналоги 12
2.4. Кандидатные белки TB10.4 и HspX 17
2.4.1. Секреторный белок TB10.4 18
2.4.2. Иммуноген из семейства белков теплового шока - HspX 19
2.5. Перспектива создания векторных вакцин мукозального применения на основе аттенуированного вируса гриппа 21
3. Материалы и методы 23
3.1. Культивирование вируса 23
3.2. Клонирование и культивирование вирусов в куриных эмбрионах 24
3.3. Выделение и очистка вирусной РНК из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов и культуральной жидкости 24
3.4. Пробоподготовка и постановка ПЦР с обратной транскрипцией 25
3.5. Электрофорез ДНК в агарозном геле 27
3.6. Определение концентрации белка с помощью флуориметра Qubit 2.0 27
3.7. Электрофорез белков в градиентном полиакриламидном геле 28
3.8. Вестерн-блоттинг и иммунодетекция белков 29
3.9. Масс-спектрометрический анализ MALDI-TOF 29
3.10. Исследование специфической безопасности вакцинного штамма 30
3.10.1. Этические принципы и регулирующие стандарты 30
3.10.2. Выбор вида и количества животных 30
3.10.3. Иммунизация животных и клинические наблюдения 31
3.10.4. Забор органов и подготовка гомогенатов тканей 31
3.10.5. Выявление генетического материала вируса гриппа А в органах методом ПЦР 31
3.10.6. Выделение вируса инфекционного вакцинного штамма из гомогенатов тканей в культуре MDCK 32
3.10.7. Схема исследования 32
3.11. Работа с трёхмерными изображениями и эпитопами 34
4. Результаты работы 35
4.1. Работа с последовательностями, трёхмерными структурами и эпитопами 35
4.2. Изучение генетической стабильности вставки антигенов в гене NS вируса A/PR8/NS124-TB10.4-2A-HspX 37
4.3. Проверка наработки белков рекомбинантными штаммами 42
4.4. Анализ белковых последовательностей с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии 45
4.5. Исследование безопасности вакцинного щтамма на мышах G57/black/6 50
4.5.1. Динамика массы тела и смертности 50
4.5.2. Детекция РНК вакцинного штамма A/PR8/NS124-TB10.4-2A-HspX из респираторного тракта мышей линии G57/black 52
4.5.3. Выделение инфекционного вируса из респираторного тракта мышей линии G57/black в клеточной культуре MDCK 53
5. Обсуждение 55
6. Выводы и заключение 58
7. Список используемой литературы 59
По данным ВОЗ, ежегодно в мире туберкулезом (ТБ) заболевают более 9 миллионов человек, среди которых около 2 млн. погибают. К настоящему времени общая численность больных достигла 60 млн. человек, из них почти 20 млн. имеют открытые формы туберкулеза. Россия входит в список стран с наибольшим бременем туберкулеза: в стране регистрируется 2,2% от всех новых случаев туберкулеза, выявляемых в мире, и 38,1% от зарегистрированных в европейском регионе (Рис.1). Несмотря на то, что показатели заболеваемости и смертности от туберкулеза в России снижаются, во всём мире регистрируется ежегодное увеличение доли больных с устойчивостью микобактерий туберкулеза (МБТ) к основным, наиболее эффективным противотуберкулезным препаратам - множественной лекарственной устойчивостью, и появление практически неизлечимой формы заболевания - туберкулеза с широкой лекарственной устойчивостью (Рис.2).
Рис.1. Ситуация с распространённостью туберкулёза по миру.
Данные на конец 2016 года [WHO global TB report, 2017].
Основным подходом к эффективному контролю распространения туберкулеза является профилактическая вакцинация, направленная на предотвращение развития открытых форм заболевания и реактивации латентных очагов эндогенной инфекции. Эффективность единственной противотуберкулезной вакцины БЦЖ (BCG, Bacillus Calmette-Guerin), являющейся живым аттенуированным штаммом Mycobacterium bovis, далеко не совершенна и преимущественно ограничена ранним детским возрастом. Это связано с тем, что напряженность иммунитета, сформированного БЦЖ, со временем снижается, и к подростковому возрасту практически исчезает. В то же время, использование БЦЖ для ревакцинации признается недостаточно эффективным [Kozakiewicz L. et. al., 2013].
Рис.2. График заболеваемости туберкулёзом в США [WHO TB Report, 2014]
Синяя кривая на диаграмме показывает типичную форму туберкулёза, зелёной кривой обозначена лекарственно-устойчивая форма
В исследованиях последних лет обоснована схема гетерологичной вакцинации, при которой для праймирования иммунного ответа используется вакцина БЦЖ (либо ее улучшенные аналоги), а для последующего бустирования - новые вакцинные кандидаты, включающие протективные микобактериальные белки. Большинство кандидатных вакцин, находящихся на стадии доклинических и клинических исследований, содержат секреторные белки микобактерий, экспрессирующиеся в фазе активной репликации патогена. При этом многие кандидатные вакцины содержат ранний секреторный белок ESAT-6, входящий в состав современных диагностических тест-систем, и поэтому не совместимы с тест-системами на основе IGRA (Interferon-gamma release assay) и препаратом «Диаскинтест».
В идеале вакцина должна эффективно защищать все группы населения, как ранее вакцинированные БЦЖ, так и инфицированные M. tuberculosis, а также предупреждать реактивацию микобактерий из дормантного состояния. Разрабатывается стратегия так называемой многоступенчатой вакцинации; при этом в состав вакцины включают латентно-ассоциированные белки M. tuberculosis. Среди наиболее изученных и эффективных антигенов, которые могут быть использованы как агенты активации антимикобактериального иммунитета, выделяют белки семейства ESAT-6 [Rv3875 (ESAT- 6), Rv3874 (CFP-10) и Rv0288 (TB10.4)] и белки трехкомпонентного антигенного комплекса Ag85 [Rv3804 (Ag85A), Rv1886 (Ag85B)]. Большой интерес в качестве латентно-ассоциированных белков-кандидатов представляют белки регулона dosR, поскольку экспрессия входящих в него генов наблюдается в большинстве условий, при которых M. tuberculosis приобретает дормантный фенотип (например, белок HspX, Rv2031c).
Так как туберкулез является инфекцией, передаваемой аэрогенным путем, мукозальные вакцины, ориентированные на формирование иммунного ответа на уровне слизистых оболочек верхних дыхательных путей, имеют преимущества над препаратами с инъекционным способом введения. Создание мукозальной бустерной вакцины на основе аттенуированного вируса гриппа, экспрессирующего белки различных фаз жизненного цикла M. tuberculosis, может решить проблему повышения защиты против туберкулеза легких, не отменяя существующие стандарты БЦЖ-вакцинации новорожденных.
Объектом разработки ФБГУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России является вакцина мукозального применения на основе аттенуированного гриппозного вектора, экспрессирующего протективные антигенные детерминанты белков TB10.4 и HspX с открытой рамки считывания белка NS1. Особенностью генетической конструкции вектора является укорочение транслируемой области белка NS1 на 50% и замещение его карбоксильной части последовательностью, кодирующей туберкулезные антигены. Интраназальная иммунизация вирусным вектором обеспечивает экспрессию антигенов МБТ в эпителиальных и антиген-презентирующих клетках респираторного тракта, что приводит к формированию мукозального и системного противотуберкулезного иммунного ответа. Выбор целевых белков определяется тем, что данные белки экспрессируются в разных фазах жизненного цикла M. tuberculosis; содержат охарактеризованные эпитопы для распознавания популяциями CD4+ и CD8+ Т-клеток для формирования сбалансированного протективного иммунного ответа клеточного типа. Эти белки содержатся в вакцинном штамме M. bovis БЦЖ и могут быть использованы для бустерной вакцинации, а также не входят в состав современных диагностических тест- систем.
Аттенуация вектора, сконструированного на основе вируса гриппа A, обеспечивается модификацией геномного NS фрагмента, приводящей к укорочению NS1 белка, что нарушает способность вируса ингибировать систему врожденного иммунитета, в частности, выработку интерферонов первого типа. Это приводит к подавлению способности вектора к продуктивной репродукции in vivo и предотвращению трансмиссии вакцинного вируса. В тоже время, усиленная выработка интерферонов первого типа и цитокинов, обладающих иммуноадъювантным действием, в зоне аппликации вакцинного штамма, вызывает усиленный иммунный ответ к антигенам МБТ, способствуя формированию протективного иммунитета.
К тому же, несмотря на модификацию геномного фрагмента NS, вакцина на основе сконструированного гриппозного вектора может нарабатываться в 10-дневных куриных эмбрионах с использованием стандартных технологических схем, применяемых для производства гриппозных вакцин.
Таким образом, целью настоящей работы является исследование молекулярно-генетических и иммунологических свойств вакцинного штамма, основанного на гриппозном векторе, который экспрессирует белки TB10.4 и HspX Mycobacterium tuberculosis.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Определение молекулярно-генетических характеристик рекомбинантного вакцинного штамма-кандидата.
2. Изучение экспрессии туберкулезных антигенов при заражении in vitro рекомбинантным штаммом культуры клеток MDCK.
3. Оценка безопасности полученного рекомбинантного вакцинного штамма-кандидата при интраназальном введении мышам линии C57/black.
Рис.1. Ситуация с распространённостью туберкулёза по миру.
Данные на конец 2016 года [WHO global TB report, 2017].
Основным подходом к эффективному контролю распространения туберкулеза является профилактическая вакцинация, направленная на предотвращение развития открытых форм заболевания и реактивации латентных очагов эндогенной инфекции. Эффективность единственной противотуберкулезной вакцины БЦЖ (BCG, Bacillus Calmette-Guerin), являющейся живым аттенуированным штаммом Mycobacterium bovis, далеко не совершенна и преимущественно ограничена ранним детским возрастом. Это связано с тем, что напряженность иммунитета, сформированного БЦЖ, со временем снижается, и к подростковому возрасту практически исчезает. В то же время, использование БЦЖ для ревакцинации признается недостаточно эффективным [Kozakiewicz L. et. al., 2013].
Рис.2. График заболеваемости туберкулёзом в США [WHO TB Report, 2014]
Синяя кривая на диаграмме показывает типичную форму туберкулёза, зелёной кривой обозначена лекарственно-устойчивая форма
В исследованиях последних лет обоснована схема гетерологичной вакцинации, при которой для праймирования иммунного ответа используется вакцина БЦЖ (либо ее улучшенные аналоги), а для последующего бустирования - новые вакцинные кандидаты, включающие протективные микобактериальные белки. Большинство кандидатных вакцин, находящихся на стадии доклинических и клинических исследований, содержат секреторные белки микобактерий, экспрессирующиеся в фазе активной репликации патогена. При этом многие кандидатные вакцины содержат ранний секреторный белок ESAT-6, входящий в состав современных диагностических тест-систем, и поэтому не совместимы с тест-системами на основе IGRA (Interferon-gamma release assay) и препаратом «Диаскинтест».
В идеале вакцина должна эффективно защищать все группы населения, как ранее вакцинированные БЦЖ, так и инфицированные M. tuberculosis, а также предупреждать реактивацию микобактерий из дормантного состояния. Разрабатывается стратегия так называемой многоступенчатой вакцинации; при этом в состав вакцины включают латентно-ассоциированные белки M. tuberculosis. Среди наиболее изученных и эффективных антигенов, которые могут быть использованы как агенты активации антимикобактериального иммунитета, выделяют белки семейства ESAT-6 [Rv3875 (ESAT- 6), Rv3874 (CFP-10) и Rv0288 (TB10.4)] и белки трехкомпонентного антигенного комплекса Ag85 [Rv3804 (Ag85A), Rv1886 (Ag85B)]. Большой интерес в качестве латентно-ассоциированных белков-кандидатов представляют белки регулона dosR, поскольку экспрессия входящих в него генов наблюдается в большинстве условий, при которых M. tuberculosis приобретает дормантный фенотип (например, белок HspX, Rv2031c).
Так как туберкулез является инфекцией, передаваемой аэрогенным путем, мукозальные вакцины, ориентированные на формирование иммунного ответа на уровне слизистых оболочек верхних дыхательных путей, имеют преимущества над препаратами с инъекционным способом введения. Создание мукозальной бустерной вакцины на основе аттенуированного вируса гриппа, экспрессирующего белки различных фаз жизненного цикла M. tuberculosis, может решить проблему повышения защиты против туберкулеза легких, не отменяя существующие стандарты БЦЖ-вакцинации новорожденных.
Объектом разработки ФБГУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России является вакцина мукозального применения на основе аттенуированного гриппозного вектора, экспрессирующего протективные антигенные детерминанты белков TB10.4 и HspX с открытой рамки считывания белка NS1. Особенностью генетической конструкции вектора является укорочение транслируемой области белка NS1 на 50% и замещение его карбоксильной части последовательностью, кодирующей туберкулезные антигены. Интраназальная иммунизация вирусным вектором обеспечивает экспрессию антигенов МБТ в эпителиальных и антиген-презентирующих клетках респираторного тракта, что приводит к формированию мукозального и системного противотуберкулезного иммунного ответа. Выбор целевых белков определяется тем, что данные белки экспрессируются в разных фазах жизненного цикла M. tuberculosis; содержат охарактеризованные эпитопы для распознавания популяциями CD4+ и CD8+ Т-клеток для формирования сбалансированного протективного иммунного ответа клеточного типа. Эти белки содержатся в вакцинном штамме M. bovis БЦЖ и могут быть использованы для бустерной вакцинации, а также не входят в состав современных диагностических тест- систем.
Аттенуация вектора, сконструированного на основе вируса гриппа A, обеспечивается модификацией геномного NS фрагмента, приводящей к укорочению NS1 белка, что нарушает способность вируса ингибировать систему врожденного иммунитета, в частности, выработку интерферонов первого типа. Это приводит к подавлению способности вектора к продуктивной репродукции in vivo и предотвращению трансмиссии вакцинного вируса. В тоже время, усиленная выработка интерферонов первого типа и цитокинов, обладающих иммуноадъювантным действием, в зоне аппликации вакцинного штамма, вызывает усиленный иммунный ответ к антигенам МБТ, способствуя формированию протективного иммунитета.
К тому же, несмотря на модификацию геномного фрагмента NS, вакцина на основе сконструированного гриппозного вектора может нарабатываться в 10-дневных куриных эмбрионах с использованием стандартных технологических схем, применяемых для производства гриппозных вакцин.
Таким образом, целью настоящей работы является исследование молекулярно-генетических и иммунологических свойств вакцинного штамма, основанного на гриппозном векторе, который экспрессирует белки TB10.4 и HspX Mycobacterium tuberculosis.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Определение молекулярно-генетических характеристик рекомбинантного вакцинного штамма-кандидата.
2. Изучение экспрессии туберкулезных антигенов при заражении in vitro рекомбинантным штаммом культуры клеток MDCK.
3. Оценка безопасности полученного рекомбинантного вакцинного штамма-кандидата при интраназальном введении мышам линии C57/black.
Выводы:
1. Был охарактеризован in silico химерный рекомбинантный белок NS124-TB10.4-2A- HspX, состоящий из укороченного белка NS1 вируса гриппа A/PR8/34 со вставкой туберкулезных антигенов TB10.4 и HspX.
2. В серии пассажей на куриных эмбрионах методом предельных разведений был получен генетически стабильный вариант рекомбинантного вируса A/PR8/NS124-TB10.4-2A- HspX, сохранявший гетерологичную вставку необходимой длины.
3. Методом вестерн-блоттинга показана экспрессия химерного рекомбинантного белка NS124-TB10.4-2A-HspX при заражении клеток MDCK рекомбинантным вирусом A/PR8-NS124-TB 10.4-2A-HspX.
4. По результатам масс-спектрометрического анализа клеточного лизата в составе химерного белка идентифицированы пептиды, соответствующие NS1, HspX и TB10.4.
5. При интраназальном введении мышам C57/black/6 рекомбинантный вирус A/PR8/NS124-TB10.4-2A-HspX обладал ограниченной способностью размножения в легких животных, не вызывая гибели животных и снижения массы тела, т.е. являлся аттенуированным по сравнению с вирусом гриппа A/PR/8/34 дикого типа.
1. Был охарактеризован in silico химерный рекомбинантный белок NS124-TB10.4-2A- HspX, состоящий из укороченного белка NS1 вируса гриппа A/PR8/34 со вставкой туберкулезных антигенов TB10.4 и HspX.
2. В серии пассажей на куриных эмбрионах методом предельных разведений был получен генетически стабильный вариант рекомбинантного вируса A/PR8/NS124-TB10.4-2A- HspX, сохранявший гетерологичную вставку необходимой длины.
3. Методом вестерн-блоттинга показана экспрессия химерного рекомбинантного белка NS124-TB10.4-2A-HspX при заражении клеток MDCK рекомбинантным вирусом A/PR8-NS124-TB 10.4-2A-HspX.
4. По результатам масс-спектрометрического анализа клеточного лизата в составе химерного белка идентифицированы пептиды, соответствующие NS1, HspX и TB10.4.
5. При интраназальном введении мышам C57/black/6 рекомбинантный вирус A/PR8/NS124-TB10.4-2A-HspX обладал ограниченной способностью размножения в легких животных, не вызывая гибели животных и снижения массы тела, т.е. являлся аттенуированным по сравнению с вирусом гриппа A/PR/8/34 дикого типа.
