📄Работа №131818
Тема: Распределение активных зон в нервно-мышечном синапсе личинки Drosophila melanogaster при экспрессии гена APP человека
Характеристики работы
Тип работы
Магистерская диссертация
Предмет
Физиология
Объем:
73 листов
Год:
2018
Просмотров:
114
5600
руб.
🛒 Купить работу
Не подходит эта работа?
Закажите новую по вашим требованиям
Узнать цену на написание
Закажите новую по вашим требованиям
Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
📋 Содержание
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 3
ВВЕДЕНИЕ 4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1. Белок предшественник амилоида и его функции 6
1.1.1. Семейство белка предшественника амилоида (Amyloid Precursor Protein, APP) 6
1.1.2. Структура APP 9
1.1.3. Процессинг APP 11
1.1.4. Физиологическая роль АРР 13
1.2. Р-амилоид 16
1.2.1. Общие сведения о Р-амилоиде 16
1.2.2. Физиологическая роль Ар 18
1.2.3. Патофизиологические эффекты Ар 19
1.3. Drosophila melanogaster как модельный объект 22
1.3.1. Drosophila melanogaster как модель для исследования влияния АРР на распределение активных зон 22
1.3.2. Краткая характеристика мышечной системы Drosophila melanogaster 23
1.3.3. Строение нервно-мышечного синапса личинки дрозофилы 27
1.3.4. Строение активных зон 30
1.3.5. Механизм экзоцитоза синаптических везикул 37
1.4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 39
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 40
2.1. Характеристика экспериментального объекта 40
2.2. Приготовление нервно-мышечного препарата личинки Drosophila melanogaster, характеристика экспериментальных условий и растворы 41
2.3. Антитела и иммуногистохимия 42
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 44
4. ВЫВОДЫ 63
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 64
БЛАГОДАРНОСТЬ 73
ВВЕДЕНИЕ 4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
1.1. Белок предшественник амилоида и его функции 6
1.1.1. Семейство белка предшественника амилоида (Amyloid Precursor Protein, APP) 6
1.1.2. Структура APP 9
1.1.3. Процессинг APP 11
1.1.4. Физиологическая роль АРР 13
1.2. Р-амилоид 16
1.2.1. Общие сведения о Р-амилоиде 16
1.2.2. Физиологическая роль Ар 18
1.2.3. Патофизиологические эффекты Ар 19
1.3. Drosophila melanogaster как модельный объект 22
1.3.1. Drosophila melanogaster как модель для исследования влияния АРР на распределение активных зон 22
1.3.2. Краткая характеристика мышечной системы Drosophila melanogaster 23
1.3.3. Строение нервно-мышечного синапса личинки дрозофилы 27
1.3.4. Строение активных зон 30
1.3.5. Механизм экзоцитоза синаптических везикул 37
1.4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 39
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 40
2.1. Характеристика экспериментального объекта 40
2.2. Приготовление нервно-мышечного препарата личинки Drosophila melanogaster, характеристика экспериментальных условий и растворы 41
2.3. Антитела и иммуногистохимия 42
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 44
4. ВЫВОДЫ 63
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 64
БЛАГОДАРНОСТЬ 73
📖 Введение
Белок предшественник амилоида (APP, amyloid precursor protein) является крупным трансмембранным белком, экспрессируемым в большинстве клеток животных. Долгое время особый интерес у исследователей вызывал только его протеолитический фрагмент (Р-амилоид, АР), главный белок амилоидных бляшек при болезни Альцгеймера (Reinhard et al., 2005). Однако в последние десятилетия увеличился процент работ по изучению функций самого APP. При нарушении экспрессии белка предшественника амилоида может нарушаться синаптическая передача и возможно появление дегенеративных процессов еще до формирования амилоидных бляшек (Masliah et al., 1994; Senechal et al., 2006).
В настоящее время продолжается исследование функций APP и Р-амилоида. Показано, что APP принимает участие в образовании синапсов и регулирует их активность, участвует в процессах памяти и обучения, однако с другой стороны он может вызывать нарушения в работе синапсов, в процессах памяти и обучения (Senechal et al., 2006; Ting et al., 2007; Mhatre et al., 2014).
Изучение функций белка предшественника амилоида необходимо для более полного понимания его физиологических и патофизиологических эффектов. Для исследования роли APP и его протеолитического продукта Р-амилоида создано множество модельных организмов, в том числе млекопитающие, нематоды, рыбы Данио рерио, дрозофила. Главным минусом использования млекопитающих для данных исследований является невозможность изучения эффекта этих белков независимо друг от друга. В связи с этим наиболее удобной моделью является Drosophila melanogaster, поскольку у нее нет генов APP и в-секретазы, соответственно, не происходит образование APP и Р-амилоида, что позволяет разделить эффекты этих белков (Chakraborty et al., 2011; Mhatre et al., 2014). Важно отметить, что удобство использования дрозофилы связано с тем, что и нервно-мышечный синапс Drosophila melanogaster, и синапсы ЦНС млекопитающих являются глутаматергическими (Collins, DiAntonio, 2007).
При экспрессии гена APP человека у дрозофилы наблюдалась нейродегенерация, нарушались процессы обучения и памяти, локомоторное поведение. Белок предшественник амилоида независимо от Р-амилоида изменяет морфологию нервного окончания в нервно-мышечной системе личинки Drosophila melanogaster, увеличивая число ветвлений и количество синаптических бутонов. Кроме того, для APP независимо от эффектов Р-амилоида показано нарушение экзоцитоза синаптических везикул, которое проявлялось в снижении частоты спонтанной квантовой секреции медиатора (Саранцева и др., 2012; Сабурова и др. 2015; Mhatre et al., 2014). Процесс экзоцитоза синаптических везикул происходит в пресинаптической активной зоне, где расположены белки, участвующие в поддержании и регулировании эффективности синаптической передачи. Активные зоны участвуют в пространственном и временном контроле слияния синаптических везикул, поэтому их распределение является объектом особого внимания (Blunk et al., 2014; Ackermann et al., 2015). Показано, что белок предшественник амилоида располагается в активной зоне и принимает участие во взаимодействии с экзоцитотическими белками, в том числе с синаптотагмином-1 (Kohli et al., 2012). Существует предположение, что главный белок активной зоны дрозофилы - Bruchpilot (Brp) - является ключевым белком, определяющим вероятность экзоцитоза синаптических везикул. В одном из исследований продемонстрировано его функциональное взаимодействие с синаптотагмином-1, и, как показано, оба этих белка играют важную роль в пространственной дифференциации активных зон (Paul et al., 2015). Активные зоны в методе иммуногистохимического окрашивания определяют по расположению белка Brp.
На данный момент данные из литературы по Р-амилоиду весьма противоречивы. И до конца неизвестно, какие морфофункциональные изменения он вызывает.
В соответствии с имеющимися данными можно предположить, что белок предшественник амилоида может влиять на распределение белка Bruchpilot (следовательно, и активных зон), что может объяснить вызываемое им нарушение процесса экзоцитоза синаптических везикул, которое проявляется в снижении частоты спонтанной квантовой секреции медиатора.
Цель работы: изучение влияния белков APP и Ар человека на распределение активных зон в синаптических бутонах нервных окончаний личинки Drosophila melanogaster при совместной экспрессии генов APP и fi-секретазы и при прямой экспрессии последовательности Ар человека.
Задачи: освоить методики препаровки личинки Drosophila melanogaster, иммуногистохимического окрашивания двигательных нейронов и активных зон и оценки распределения активных зон в бутонах нервных окончаний у личинок трех линий Drosophila melanogaster: контрольной, линии с одновременной экспрессией генов APP и fi-секретазы человека, в которой происходит образование и APP, и Р-амилоида, и линия с прямой экспрессией последовательности Ар человека, где образуется только Р-амилоид.
Работа выполнена в рамках НИР, поддержанной грантом Санкт-Петербургского государственного университета № 1.38.231.2014 (рук. проф. А.Г. Марков).
В настоящее время продолжается исследование функций APP и Р-амилоида. Показано, что APP принимает участие в образовании синапсов и регулирует их активность, участвует в процессах памяти и обучения, однако с другой стороны он может вызывать нарушения в работе синапсов, в процессах памяти и обучения (Senechal et al., 2006; Ting et al., 2007; Mhatre et al., 2014).
Изучение функций белка предшественника амилоида необходимо для более полного понимания его физиологических и патофизиологических эффектов. Для исследования роли APP и его протеолитического продукта Р-амилоида создано множество модельных организмов, в том числе млекопитающие, нематоды, рыбы Данио рерио, дрозофила. Главным минусом использования млекопитающих для данных исследований является невозможность изучения эффекта этих белков независимо друг от друга. В связи с этим наиболее удобной моделью является Drosophila melanogaster, поскольку у нее нет генов APP и в-секретазы, соответственно, не происходит образование APP и Р-амилоида, что позволяет разделить эффекты этих белков (Chakraborty et al., 2011; Mhatre et al., 2014). Важно отметить, что удобство использования дрозофилы связано с тем, что и нервно-мышечный синапс Drosophila melanogaster, и синапсы ЦНС млекопитающих являются глутаматергическими (Collins, DiAntonio, 2007).
При экспрессии гена APP человека у дрозофилы наблюдалась нейродегенерация, нарушались процессы обучения и памяти, локомоторное поведение. Белок предшественник амилоида независимо от Р-амилоида изменяет морфологию нервного окончания в нервно-мышечной системе личинки Drosophila melanogaster, увеличивая число ветвлений и количество синаптических бутонов. Кроме того, для APP независимо от эффектов Р-амилоида показано нарушение экзоцитоза синаптических везикул, которое проявлялось в снижении частоты спонтанной квантовой секреции медиатора (Саранцева и др., 2012; Сабурова и др. 2015; Mhatre et al., 2014). Процесс экзоцитоза синаптических везикул происходит в пресинаптической активной зоне, где расположены белки, участвующие в поддержании и регулировании эффективности синаптической передачи. Активные зоны участвуют в пространственном и временном контроле слияния синаптических везикул, поэтому их распределение является объектом особого внимания (Blunk et al., 2014; Ackermann et al., 2015). Показано, что белок предшественник амилоида располагается в активной зоне и принимает участие во взаимодействии с экзоцитотическими белками, в том числе с синаптотагмином-1 (Kohli et al., 2012). Существует предположение, что главный белок активной зоны дрозофилы - Bruchpilot (Brp) - является ключевым белком, определяющим вероятность экзоцитоза синаптических везикул. В одном из исследований продемонстрировано его функциональное взаимодействие с синаптотагмином-1, и, как показано, оба этих белка играют важную роль в пространственной дифференциации активных зон (Paul et al., 2015). Активные зоны в методе иммуногистохимического окрашивания определяют по расположению белка Brp.
На данный момент данные из литературы по Р-амилоиду весьма противоречивы. И до конца неизвестно, какие морфофункциональные изменения он вызывает.
В соответствии с имеющимися данными можно предположить, что белок предшественник амилоида может влиять на распределение белка Bruchpilot (следовательно, и активных зон), что может объяснить вызываемое им нарушение процесса экзоцитоза синаптических везикул, которое проявляется в снижении частоты спонтанной квантовой секреции медиатора.
Цель работы: изучение влияния белков APP и Ар человека на распределение активных зон в синаптических бутонах нервных окончаний личинки Drosophila melanogaster при совместной экспрессии генов APP и fi-секретазы и при прямой экспрессии последовательности Ар человека.
Задачи: освоить методики препаровки личинки Drosophila melanogaster, иммуногистохимического окрашивания двигательных нейронов и активных зон и оценки распределения активных зон в бутонах нервных окончаний у личинок трех линий Drosophila melanogaster: контрольной, линии с одновременной экспрессией генов APP и fi-секретазы человека, в которой происходит образование и APP, и Р-амилоида, и линия с прямой экспрессией последовательности Ар человека, где образуется только Р-амилоид.
Работа выполнена в рамках НИР, поддержанной грантом Санкт-Петербургского государственного университета № 1.38.231.2014 (рук. проф. А.Г. Марков).
✅ Заключение
На данный момент весьма актуально исследование физиологических и патофизиологических эффектов APP и Лр, поскольку продемонстрирована их важная роль в функционировании клеток (Мухамедьяров, Зефиров, 2013; Zheng, Koo, 2006). Изучение роли этих белков может пролить свет на причины и механизмы возникновения ряда заболеваний, в том числе болезни Альцгеймера. У млекопитающих изменение экспрессии белка предшественника амилоида может вызывать дисфункцию синапсов и различные морфологические нарушения, а его протеолитический фрагмент Лр может оказывать влияние на синаптическую передачу и пластичность (Ting et al., 2007; Tyan et al., 2012; Carrillo-Mora et al., 2014). Однако млекопитающие являются не самой удачной моделью для данных исследований, поскольку не представляется возможным разделить эффекты APP и Лр. Именно поэтому более удобной моделью считается личинка Drosophila melanogaster, так как существует возможность исследовать влияние этих белков независимо друг от друга.
ВЫВОДЫ
1. В условиях ко-экспрессии генов APP и ft-секретазы человека наблюдалось увеличение количества синаптических бутонов и общего количества активных зон в нервных окончаниях, иннервирующих 6 и 7 мышечные волокна личинки Drosophila melanogaster.
2. Наблюдаемые изменения сопровождались снижением числа активных зон в индивидуальных бутонах и площади бутонов.
3. При прямой экспрессии ft-амилоида человека анализируемые параметры не отличались от контрольных, что указывает на специфичность наблюдаемых эффектов для APP.
4. Полученные данные свидетельствуют о возможной роли белка-предшественника амилоида (APP) в структурной и функциональной организации активной зоны у Drosophila melanogaster.
ВЫВОДЫ
1. В условиях ко-экспрессии генов APP и ft-секретазы человека наблюдалось увеличение количества синаптических бутонов и общего количества активных зон в нервных окончаниях, иннервирующих 6 и 7 мышечные волокна личинки Drosophila melanogaster.
2. Наблюдаемые изменения сопровождались снижением числа активных зон в индивидуальных бутонах и площади бутонов.
3. При прямой экспрессии ft-амилоида человека анализируемые параметры не отличались от контрольных, что указывает на специфичность наблюдаемых эффектов для APP.
4. Полученные данные свидетельствуют о возможной роли белка-предшественника амилоида (APP) в структурной и функциональной организации активной зоны у Drosophila melanogaster.
ИЛИ
Поиск аналога
📕 Список литературы
🖼 Скриншоты
🛒 Оформить заказ
⚡ Работу высылаем в течении 5 минут после оплаты.