Исследование таксономической структуры почвенного и ризосферного микробиомов различных сортов Triticum aestivum (Пшеница мягкая) и Secale cereale (Рожь посевная), культивируемых в двух типах почв
|
Список сокращений 2
Введение 4
Обзор литературы 7
1. История развития исследований микробного сообщества ризосферы. Ассоциативные микроорганизмы 7
2. Развитие метагеномного подхода к исследованию биоразнообразия 10
3. Биоинформационный анализ данных по таксономической структуре микробиомов 15
4. Особенности исследования ризосферного микробиома 17
5. Современные исследования ризосферного микробиома 18
Материалы и методы исследования 22
1. Объекты исследования 22
2. Методы исследования 23
2.1. Постановка вегетационного опыта 23
2.2. Выделение и очистка ДНК 23
2.3. Биоинформационный анализ данных 24
Результаты и обсуждение 26
1. Биоинформационный анализ результатов секвенирования нуклеотидных последовательностей 26
2. Метагеномная характеристика ризосферного эффекта 31
2.1. Анализ показателей альфа-разнообразия 31
2.2. Анализ показателей бета-разнообразия (кластерный анализ РСоА) 32
2.3. Анализ таксономической структуры сообществ 36
Заключение 42
Выводы 43
Список литературы 44
Введение 4
Обзор литературы 7
1. История развития исследований микробного сообщества ризосферы. Ассоциативные микроорганизмы 7
2. Развитие метагеномного подхода к исследованию биоразнообразия 10
3. Биоинформационный анализ данных по таксономической структуре микробиомов 15
4. Особенности исследования ризосферного микробиома 17
5. Современные исследования ризосферного микробиома 18
Материалы и методы исследования 22
1. Объекты исследования 22
2. Методы исследования 23
2.1. Постановка вегетационного опыта 23
2.2. Выделение и очистка ДНК 23
2.3. Биоинформационный анализ данных 24
Результаты и обсуждение 26
1. Биоинформационный анализ результатов секвенирования нуклеотидных последовательностей 26
2. Метагеномная характеристика ризосферного эффекта 31
2.1. Анализ показателей альфа-разнообразия 31
2.2. Анализ показателей бета-разнообразия (кластерный анализ РСоА) 32
2.3. Анализ таксономической структуры сообществ 36
Заключение 42
Выводы 43
Список литературы 44
Разнообразие микроорганизмов, ассоциированных с корнями растений, огромно и составляет десятки тысяч видов. Однако лишь недавно была признана колоссальная роль микробиома в жизни растения и выдвинута идея о рассмотрении его в качестве второго генома растения (Berendsen et al., 2012). Понимание механизмов формирования и функциональной нагрузки ризосферного микробиома позволит разработать эффективные системы повышения продуктивности растений, обогатит наши знания в области экологии растительно-микробных взаимодействий.
Первые работы в области растительно-микробных взаимодействий появились около 150 лет назад, большая часть из них была направлена на поиски микробиологических факторов продуктивности культурных растений. Прежде всего ученых интересовали азотфиксирующие, рост стимулирующие микроорганизмы, а также патогенная микробиота. Особое внимание уделялось изучению морфологических и физиологических свойств полученных штаммов и их влияния на растение, предоставляющее ризосферную нишу.
Однако вскоре стало понятно, что в ризосфере существуют так называемые некуль- тивируемые бактерии и археи, присутствие которых невозможно детектировать традиционными методами культивирования на питательных средах (Hugenholtz et al., 1998; Oliver et al., 2005; Handelsman et al., 2004). Появление новых методов, основанных на секвенировании выделяемых из среды нуклеотидных последовательностей, позволило перейти к анализу этой многочисленной группы микроорганизмов (по разным оценкам некультиви- руемые микроорганизмы могут составлять от 90% до 99% состава сообщества). При исследовании некультивируемой части микробного сообщества, объектом исследования становится метагеном - совокупный генетический материал экосистемы (Vogel et al., 2009; Riesenfeld et al., 2004). Последующий анализ позволяет в зависимости от задач исследования произвести оценку таксономической и/или функциональной структуры сообщества посредством выбора ген-специфичных праймеров и/или секвенирования полноразмерных геномов. В качестве филогенетического маркера для прокариотов в подавляющем большинстве работ используется структура вариабельных участков гена 16S рРНК.
Использование метагеномных технологий при исследовании сообществ ризосферы имеет ряд преимуществ, связанных с возможностью более полной детекции состава сообщества, меньшей трудоемкостью и быстротой анализа. Кроме того, метагеномные методы позволяют проводить исследование биологических объектов на генном и геномном уровне, исследовать метаболические пути, вовлеченные во взаимодействие отдельных компонентов микробного сообщества и предполагать их функции. Все это позволяет постепенно выходить на системный уровень понимания закономерностей функционирования почвенных микробных сообществ. В перспективе ожидается появление проектов по комплексному исследованию метагенома, транскриптома, протеома, метаболома, что обеспечит дальнейшее развитие идеи объединенного анализа.
На данный момент эта тема чрезвычайно актуальна в зарубежной науке - организованы проекты по изучению ризосферного микробиома модельных объектов, таких как Arabidopsis thaliana, активно изучается ризосферный микробиом сельскохозяйственнозначимых культур - Oryza sativa, Zea mays, Lactuca sativa.
Однако метагеномный подход к исследованию разнообразия находится сегодня на стадии становления и ставит перед учеными ряд сложных задач, основными из которых являются воспроизводимость данных секвенирования, зависящая от глубины секвенирования и числа повторностей, а также биологическая интерпретация получаемых результатов. Поскольку метагеномные исследования ризосферного микробиома практически не представлены в отечественной научной литературе, одной из задач данного исследования стал анализ воспроизводимости данных высокопроизводительного секвенирования при проведении такого рода анализа.
Новизна данной работы также обусловлена выбранными объектами исследования - ризосферными комплексами, наиболее характерными для территории России и состоящими из почв и сортов культурных растений, типичных для российского агропромышленного комплекса (АПК).
Таким образом, целью данной работы является исследование таксономической структуры почвенного и ризосферного микробиомов различных сортов Triticum aestivum (Пшеница мягкая) и Secale cereale (Рожь посевная), культивируемых в черноземной и дерново-подзолистой почвах.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Провести постановку модельного опыта по культивированию двух сортов Triticum aestivum (Пшеница мягкая) и двух сортов Secale cereale (Рожь посевная) в дерново-подзолистой почве и черноземе.
2. Выделить ДНК из образцов контрольной и ризосферной почвы и провести секвенирование гена 16S рРНК почвенных бактерий и архей
3. Определить таксономический состав микробиомов в образцах почвы и ризосферы растений.
4. Провести биоинформационный анализ данных с расчетом индексов альфа и бета разнообразия.
5. Сравнить таксономический состав ризосферного и почвенного микробиомов и выявить группы бактерий, достоверно изменяющих свою долю в ризосферах культивируемых растений.
Первые работы в области растительно-микробных взаимодействий появились около 150 лет назад, большая часть из них была направлена на поиски микробиологических факторов продуктивности культурных растений. Прежде всего ученых интересовали азотфиксирующие, рост стимулирующие микроорганизмы, а также патогенная микробиота. Особое внимание уделялось изучению морфологических и физиологических свойств полученных штаммов и их влияния на растение, предоставляющее ризосферную нишу.
Однако вскоре стало понятно, что в ризосфере существуют так называемые некуль- тивируемые бактерии и археи, присутствие которых невозможно детектировать традиционными методами культивирования на питательных средах (Hugenholtz et al., 1998; Oliver et al., 2005; Handelsman et al., 2004). Появление новых методов, основанных на секвенировании выделяемых из среды нуклеотидных последовательностей, позволило перейти к анализу этой многочисленной группы микроорганизмов (по разным оценкам некультиви- руемые микроорганизмы могут составлять от 90% до 99% состава сообщества). При исследовании некультивируемой части микробного сообщества, объектом исследования становится метагеном - совокупный генетический материал экосистемы (Vogel et al., 2009; Riesenfeld et al., 2004). Последующий анализ позволяет в зависимости от задач исследования произвести оценку таксономической и/или функциональной структуры сообщества посредством выбора ген-специфичных праймеров и/или секвенирования полноразмерных геномов. В качестве филогенетического маркера для прокариотов в подавляющем большинстве работ используется структура вариабельных участков гена 16S рРНК.
Использование метагеномных технологий при исследовании сообществ ризосферы имеет ряд преимуществ, связанных с возможностью более полной детекции состава сообщества, меньшей трудоемкостью и быстротой анализа. Кроме того, метагеномные методы позволяют проводить исследование биологических объектов на генном и геномном уровне, исследовать метаболические пути, вовлеченные во взаимодействие отдельных компонентов микробного сообщества и предполагать их функции. Все это позволяет постепенно выходить на системный уровень понимания закономерностей функционирования почвенных микробных сообществ. В перспективе ожидается появление проектов по комплексному исследованию метагенома, транскриптома, протеома, метаболома, что обеспечит дальнейшее развитие идеи объединенного анализа.
На данный момент эта тема чрезвычайно актуальна в зарубежной науке - организованы проекты по изучению ризосферного микробиома модельных объектов, таких как Arabidopsis thaliana, активно изучается ризосферный микробиом сельскохозяйственнозначимых культур - Oryza sativa, Zea mays, Lactuca sativa.
Однако метагеномный подход к исследованию разнообразия находится сегодня на стадии становления и ставит перед учеными ряд сложных задач, основными из которых являются воспроизводимость данных секвенирования, зависящая от глубины секвенирования и числа повторностей, а также биологическая интерпретация получаемых результатов. Поскольку метагеномные исследования ризосферного микробиома практически не представлены в отечественной научной литературе, одной из задач данного исследования стал анализ воспроизводимости данных высокопроизводительного секвенирования при проведении такого рода анализа.
Новизна данной работы также обусловлена выбранными объектами исследования - ризосферными комплексами, наиболее характерными для территории России и состоящими из почв и сортов культурных растений, типичных для российского агропромышленного комплекса (АПК).
Таким образом, целью данной работы является исследование таксономической структуры почвенного и ризосферного микробиомов различных сортов Triticum aestivum (Пшеница мягкая) и Secale cereale (Рожь посевная), культивируемых в черноземной и дерново-подзолистой почвах.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Провести постановку модельного опыта по культивированию двух сортов Triticum aestivum (Пшеница мягкая) и двух сортов Secale cereale (Рожь посевная) в дерново-подзолистой почве и черноземе.
2. Выделить ДНК из образцов контрольной и ризосферной почвы и провести секвенирование гена 16S рРНК почвенных бактерий и архей
3. Определить таксономический состав микробиомов в образцах почвы и ризосферы растений.
4. Провести биоинформационный анализ данных с расчетом индексов альфа и бета разнообразия.
5. Сравнить таксономический состав ризосферного и почвенного микробиомов и выявить группы бактерий, достоверно изменяющих свою долю в ризосферах культивируемых растений.
Данная работа представляет собой первый этап в выявлении закономерностей формировании ризосферного микробиома в зависимости от типа почвы, а также от вида и сорта растения.
Следует отметить, что на основании расчетов выборочного усилия было охвачено чуть менее половины истинного разнообразия сообществ, что объясняет значительные отличия между повторностями. При сравнении выявленных в повторностях микробиомов были обнаружены достоверные различия, что, по всей вероятности, обусловлено низкой глубиной секвенирования, а также высокой степенью структурной гетерогенности почвы. На основании этих данных был сделан вывод о необходимости увеличения числа повторностей для наиболее точного описания структуры сообществ, при этом величина выборочного усилия должна определяться отдельно для каждого типа почв.
Традиционный экологический анализ показателей разнообразия показал, что основным фактором, влияющим на разнообразие ризосферных микробиомов, является тип почвы, в меньшей степени влияние на состав микробиомов ризосферы оказывают вид и сорт культивируемых растений.
Среди выявленных таксонов в «ризосферном эффекте» достоверно принимают участие микроорганизмы, принадлежащие к группам Comamonadaceae, Solirubrobacterales, Gaiellaceae, Oxalobacteraceae, Acidobacteria, Micrococcaceae и др., при этом часть их присутствовала как ризосфере ржи, так и в ризосфере пшеницы, в частности Oxalobacteraceae, Gaiellaceae, Acidobacteria.
В ходе дальнейших исследований нами планируется предварительный учет разнообразия нативного микробиома почвы для увеличения детектируемой части сообщества с помощью увеличения числа повторностей. Другим интересным направлением представляется изучение влияния на «рекрутируемые микробиомы» стадии онтогенетического развития растения, а также увеличение числа сортов для подтверждения некоторых выявленных в данной работе тенденций.
Таким образом, в работе показано, что для интерпретации метагеномных данных недостаточно проведения одного опыта, а необходим ряд предварительных экспериментов, выявляющих определенный круг проблем, таких, к примеру, необходимая и достаточная величина выборки. Вместе с тем в ходе работы были получены результаты, которые будут использованы для оптимального планирования будущих экспериментов в данном исследовательском направлении.
Следует отметить, что на основании расчетов выборочного усилия было охвачено чуть менее половины истинного разнообразия сообществ, что объясняет значительные отличия между повторностями. При сравнении выявленных в повторностях микробиомов были обнаружены достоверные различия, что, по всей вероятности, обусловлено низкой глубиной секвенирования, а также высокой степенью структурной гетерогенности почвы. На основании этих данных был сделан вывод о необходимости увеличения числа повторностей для наиболее точного описания структуры сообществ, при этом величина выборочного усилия должна определяться отдельно для каждого типа почв.
Традиционный экологический анализ показателей разнообразия показал, что основным фактором, влияющим на разнообразие ризосферных микробиомов, является тип почвы, в меньшей степени влияние на состав микробиомов ризосферы оказывают вид и сорт культивируемых растений.
Среди выявленных таксонов в «ризосферном эффекте» достоверно принимают участие микроорганизмы, принадлежащие к группам Comamonadaceae, Solirubrobacterales, Gaiellaceae, Oxalobacteraceae, Acidobacteria, Micrococcaceae и др., при этом часть их присутствовала как ризосфере ржи, так и в ризосфере пшеницы, в частности Oxalobacteraceae, Gaiellaceae, Acidobacteria.
В ходе дальнейших исследований нами планируется предварительный учет разнообразия нативного микробиома почвы для увеличения детектируемой части сообщества с помощью увеличения числа повторностей. Другим интересным направлением представляется изучение влияния на «рекрутируемые микробиомы» стадии онтогенетического развития растения, а также увеличение числа сортов для подтверждения некоторых выявленных в данной работе тенденций.
Таким образом, в работе показано, что для интерпретации метагеномных данных недостаточно проведения одного опыта, а необходим ряд предварительных экспериментов, выявляющих определенный круг проблем, таких, к примеру, необходимая и достаточная величина выборки. Вместе с тем в ходе работы были получены результаты, которые будут использованы для оптимального планирования будущих экспериментов в данном исследовательском направлении.
Подобные работы
- Исследование таксономической структуры почвенного и ризосферного микробиомов различных сортов Triticum aestivum (Пшеница мягкая) и Secale cereale (Рожь посевная), культивируемых в двух типах почв
Бакалаврская работа, биология. Язык работы: Русский. Цена: 4760 р. Год сдачи: 2016