Тема: Исследование таксономической структуры почвенного и ризосферного микробиомов различных сортов Triticum aestivum (Пшеница мягкая) и Secale cereale (Рожь посевная), культивируемых в двух типах почв

Разнообразие микроорганизмов, ассоциированных с корнями растений, огромно и составляет десятки тысяч видов. Однако лишь недавно была признана колоссальная роль микробиома в жизни растения и выдвинута идея о рассмотрении его в качестве второго генома растения (Berendsen et al., 2012). Понимание механизмов формирования и функ­циональной нагрузки ризосферного микробиома позволит разработать эффективные сис­темы повышения продуктивности растений, обогатит наши знания в области экологии растительно-микробных взаимодействий.
Первые работы в области растительно-микробных взаимодействий появились око­ло 150 лет назад, большая часть из них была направлена на поиски микробиологических факторов продуктивности культурных растений. Прежде всего ученых интересовали азотфиксирующие, рост стимулирующие микроорганизмы, а также патогенная микробио­та. Особое внимание уделялось изучению морфологических и физиологических свойств полученных штаммов и их влияния на растение, предоставляющее ризосферную нишу.
Однако вскоре стало понятно, что в ризосфере существуют так называемые некуль- тивируемые бактерии и археи, присутствие которых невозможно детектировать традици­онными методами культивирования на питательных средах (Hugenholtz et al., 1998; Oliver et al., 2005; Handelsman et al., 2004). Появление новых методов, основанных на секвениро­вании выделяемых из среды нуклеотидных последовательностей, позволило перейти к анализу этой многочисленной группы микроорганизмов (по разным оценкам некультиви- руемые микроорганизмы могут составлять от 90% до 99% состава сообщества). При ис­следовании некультивируемой части микробного сообщества, объектом исследования становится метагеном - совокупный генетический материал экосистемы (Vogel et al., 2009; Riesenfeld et al., 2004). Последующий анализ позволяет в зависимости от задач ис­следования произвести оценку таксономической и/или функциональной структуры сооб­щества посредством выбора ген-специфичных праймеров и/или секвенирования полно­размерных геномов. В качестве филогенетического маркера для прокариотов в подавляю­щем большинстве работ используется структура вариабельных участков гена 16S рРНК.
Использование метагеномных технологий при исследовании сообществ ризосферы имеет ряд преимуществ, связанных с возможностью более полной детекции состава сооб­щества, меньшей трудоемкостью и быстротой анализа. Кроме того, метагеномные методы позволяют проводить исследование биологических объектов на генном и геномном уров­не, исследовать метаболические пути, вовлеченные во взаимодействие отдельных компо­нентов микробного сообщества и предполагать их функции. Все это позволяет постепенно выходить на системный уровень понимания закономерностей функционирования почвен­ных микробных сообществ. В перспективе ожидается появление проектов по комплекс­ному исследованию метагенома, транскриптома, протеома, метаболома, что обеспечит дальнейшее развитие идеи объединенного анализа.
На данный момент эта тема чрезвычайно актуальна в зарубежной науке - организо­ваны проекты по изучению ризосферного микробиома модельных объектов, таких как Arabidopsis thaliana, активно изучается ризосферный микробиом сельскохозяйственнозначимых культур - Oryza sativa, Zea mays, Lactuca sativa.
Однако метагеномный подход к исследованию разнообразия находится сегодня на стадии становления и ставит перед учеными ряд сложных задач, основными из которых являются воспроизводимость данных секвенирования, зависящая от глубины секвениро­вания и числа повторностей, а также биологическая интерпретация получаемых результа­тов. Поскольку метагеномные исследования ризосферного микробиома практически не представлены в отечественной научной литературе, одной из задач данного исследования стал анализ воспроизводимости данных высокопроизводительного секвенирования при проведении такого рода анализа.
Новизна данной работы также обусловлена выбранными объектами исследования - ризосферными комплексами, наиболее характерными для территории России и состоя­щими из почв и сортов культурных растений, типичных для российского агропромыш­ленного комплекса (АПК).
Таким образом, целью данной работы является исследование таксономической структуры почвенного и ризосферного микробиомов различных сортов Triticum aestivum (Пшеница мягкая) и Secale cereale (Рожь посевная), культивируемых в черноземной и дерново-подзолистой почвах.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
1. Провести постановку модельного опыта по культивированию двух сортов Triticum aestivum (Пшеница мягкая) и двух сортов Secale cereale (Рожь посев­ная) в дерново-подзолистой почве и черноземе.
2. Выделить ДНК из образцов контрольной и ризосферной почвы и провести сек­венирование гена 16S рРНК почвенных бактерий и архей
3. Определить таксономический состав микробиомов в образцах почвы и ризо­сферы растений.
4. Провести биоинформационный анализ данных с расчетом индексов альфа и бе­та разнообразия.
5. Сравнить таксономический состав ризосферного и почвенного микробиомов и выявить группы бактерий, достоверно изменяющих свою долю в ризосферах культивируемых растений.
Купить

Данная работа представляет собой первый этап в выявлении закономерностей фор­мировании ризосферного микробиома в зависимости от типа почвы, а также от вида и сорта растения.
Следует отметить, что на основании расчетов выборочного усилия было охвачено чуть менее половины истинного разнообразия сообществ, что объясняет значительные от­личия между повторностями. При сравнении выявленных в повторностях микробиомов были обнаружены достоверные различия, что, по всей вероятности, обусловлено низкой глубиной секвенирования, а также высокой степенью структурной гетерогенности почвы. На основании этих данных был сделан вывод о необходимости увеличения числа повтор­ностей для наиболее точного описания структуры сообществ, при этом величина выбо­рочного усилия должна определяться отдельно для каждого типа почв.
Традиционный экологический анализ показателей разнообразия показал, что ос­новным фактором, влияющим на разнообразие ризосферных микробиомов, является тип почвы, в меньшей степени влияние на состав микробиомов ризосферы оказывают вид и сорт культивируемых растений.
Среди выявленных таксонов в «ризосферном эффекте» достоверно принимают уча­стие микроорганизмы, принадлежащие к группам Comamonadaceae, Solirubrobacterales, Gaiellaceae, Oxalobacteraceae, Acidobacteria, Micrococcaceae и др., при этом часть их при­сутствовала как ризосфере ржи, так и в ризосфере пшеницы, в частности Oxalobacteraceae, Gaiellaceae, Acidobacteria.
В ходе дальнейших исследований нами планируется предварительный учет разно­образия нативного микробиома почвы для увеличения детектируемой части сообщества с помощью увеличения числа повторностей. Другим интересным направлением представ­ляется изучение влияния на «рекрутируемые микробиомы» стадии онтогенетического развития растения, а также увеличение числа сортов для подтверждения некоторых выяв­ленных в данной работе тенденций.
Таким образом, в работе показано, что для интерпретации метагеномных данных недостаточно проведения одного опыта, а необходим ряд предварительных эксперимен­тов, выявляющих определенный круг проблем, таких, к примеру, необходимая и доста­точная величина выборки. Вместе с тем в ходе работы были получены результаты, кото­рые будут использованы для оптимального планирования будущих экспериментов в дан­ном исследовательском направлении.
Купить