СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Формирование сердца в эмбриональном периоде.
1.2. Развитие аортального клапана
1.3. Развитие двухстворчатого аортального клапана
1.4. Генетические механизмы формирования бикуспидального аортального клапана
(БАК)
1.5. Аортальный стеноз
1.6. Механизмы оссификации и кальцификации тканей
1.7. Молекулярные механизмы кальцификации.
1.8. Эндотелиально-мезенхимный переход..
1.9. Сигнальный путь Notch и его компоненты
1.10. Участие сигнального пути Notch в развитии кальцификации аортального
клапана
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Клеточные культуры
2.1.2. Штаммы бактерий
2.1.3. Плазмиды.
2.1.4. Праймеры
2.2. Методы.
2.2.1. Трансформация бактерий
2.2.2. Выделение плазмидной ДНК
2.2.3. Производство лентивирусных частиц
2.2.5. Магнитный сортинг CD31-позитивных клеток.
2.2.6. Культивирование интерстициальных и эндотелиальных клеток аортального
клапана человека
2.2.7. Сокультивирование интерстициальных клеток аортального клапана с
эндотелиальными клетками
2.2.8. Трансдукция интерстициальных клеток аортального клапана
лентивирусными частицами
2.2.9. Остеогенная дифференцировка интерстициальных клеток клапана аорты ....38
2.2.10. Окраска дифференцированных в остеогенном направлении
интерстициальных клеток аортального клапана
2.2.11. Выделение РНК из клеточных культур
2.2.12. Обратная транскрипция
2.2.13. ПЦР в реальном времени.
2.2.14. Статистическая обработка данных и построение графиков..............................41
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Динамика экспрессии остеогенов при индукции остеогенной дифференцировки и
активации сигнального пути Notch
3.2. Сокультивирование эндотелиальных и интерстициальных клеток клапана аорты
усиливает остеогенную дифференцировку клеток и активирует Notch.............................45
3.3. Активация сигнального пути Notch ведет к дозозависимому усилению
остеогенной дифференцировки клеток
3.4. Различия между группами пациентов и здоровых людей по уровню активности
сигнального пути Notch и про-остеогенным маркерам коллагену и периостину .............50
4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...
Кальцифицированный стеноз аортального клапана является третьей ведущей причиной сердечно-сосудистых заболеваний (Iung et al., 2003). Единственным существующим на сегодняшний день вариантом лечения является операция на сердце с имплантацией протеза клапана.
Риск возникновения кальцификации сердечного клапана увеличивается с возрастом (Stewart et al., 1997). Главной особенностью заболевания является прогрессивная минерализация ткани клапана. Механизмы, лежащие в основе этого процесса, остаются неясными, однако в последние годы стало понятно, что патологическая минерализация тканей сердца и сосудов имеет некоторые сходства с физиологическим процессом образования кости (Mathieu et al., 2014).
Створки аортального клапана состоят из интерстициальных клеток (ИК) и эндотелиальных клеток клапана (ЭК). Полагают, что интерстициальные клетки являются основными функциональными единицами в клапане, которые подвергаются минерализации (RabkinAikawa et al., 2004). Однако, эндотелиальные клетки также могут принимать активное участие в минерализации (Hjortnaes et al., 2015; Cheng et al., 2013; Yao et al., 2013). В последнее десятилетие стало понятно, что прогрессирующий фиброз клапана и минерализация являются активными, а не пассивными процессами.
Notch – это ключевой сигнальный путь, играющий обширную роль в развитии, обеспечивающий перекрестное сообщение между различными типами клеток и их физиологической дифференцировкой (Andersson et al., 2011), и также он особенно важен в процессах формирования сердечно-сосудистой системы. Все рецепторы Notch (Notch1-4) и лиганды (Jag1 и 2 и Dll1, 3 и 4) экспрессируются в сосудистой системе. Активация Notchрецепторов требует их связывания с трансмембранным лигандом, представленным на соседних клетках. Это связывание вызывает серию последовательных протеолитических расщеплений в рецепторе, что в конечном итоге приводит к высвобождению активированного внутриклеточного домена рецептора Notch (Notch intracellular domain – NICD), который является транскрипционно активной формой Notch. NICD транслоцируется в ядро, где он регулирует широкий спектр генов-мишеней (Andersson et al., 2011).6
Существующие данные о роли Notch в кальцификации аортального клапана довольно противоречивы. Notch1 может ингибировать кальцификацию аортального клапана (Acharya et al., 2011). Однако имеются противоположные данные, свидетельствующие о том, что Notch1 может поддерживать остеогенную дифференцировку в человеческих ИК (Zeng et al., 2013). Гаплонедостаточность по NOTCH1 способствует, согласно исследованиям одной группы, экспрессии про-остеогеннов и генов, отвечающих за развитие воспалительных процессов (Theodoris et al., 2015).
Таким образом, целью данной работы стало изучить роль сигнального пути Notch в кальцификации аортального клапана человека.
Для достижения указанной цели, были поставлены следующие экспериментальные задачи:
• Выявить гены, экспрессирующиеся на начальных этапах остеогенной дифференцировки
• Изучить влияние межклеточных взаимодействий между эндотелиальными и интерстициальными клетками на остеогенную дифференцировку
• Изучить эффект активации Notch на остеогенную дифференцировку интерстициальных клеток аортального клапана
• Выяснить, существуют ли различия в уровне активации сигнального пути Notch и остеогенных генов между пациентами с кальцификацией аортального клапана и здоровыми людьми
• Сокультивирование интерстициальных клеток клапана аорты с эндотелиальными значительно усиливает степень остеогенной дифференцировки
• Активация сигнального пути Notch приводит к дозозависимому усилению остеогенной дифференцировки интерстициальных клеток аортального клапана
• Обнаружены различия между группами пациентов и здоровых людей по уровню активности сигнального пути Notch и остеогенным маркерам коллагену и периостину
