Функциональная морфология ядра в растущих ооцитах красноухой черепахи Trachemys scripta
|
Введение 5
1. Обзор литературы 7
1.1 Хромосомы типа ламповых щёток 7
1.2 Внутриядерные тельца: Ядрышки 11
1.3 Другие внутриядерные тельца 15
1.4 Кариотип Trachemys scripta 16
1.5 Оогенез Trachemys scripta 17
1.6 Биоинформатический обзор IGS 19
2. Материал и методы 22
2.1 Объект исследования 22
2.2 Фиксация тканей 22
2.3 Замораживание образцов 22
2.4 Приготовление криосрезов и отбор препаратов для исследования 22
2.5 Предподготовка или постфиксация препаратов для FISH или ИГХ 23
2.6 Зонд к последовательности 5' ETS рибосомного кластера 23
2.7 FISH на криосрезах яичников 24
2.8 Детекция сигнала FISH с помошью ИГХ 25
2.9 Иммуногистохимия 26
2.10 Использованные антитела 26
2.11 Красители и флуоресцентные метки 27
2.12 Препараты изолированных из ооцитов ядер и хромосом типа ЛЩ 27
2.13 Окраска изолированных ядер 28
2.14 Микроскопия 28
2.15 Программное обеспечение для анализа снимков и их обработки 28
3. Результаты 29
3.1 Общая морфология ядра в растущих ооцитах T. scripta 29
3.2 Характеристика хромосом в растущих ооцитах 30
3.3 Цитологические карты макрохромосом и микрохромосом 37
3.4 Нуклеолярный аппарат в растущих ооцитах T. scripta 39
3.5 Анализ транскрипционной активности рибосомных генов 41
3.6 Биоинформатический анализ последовательности IGS 43
4. Обсуждение 45
4.1 Хромосомы типа ламповых щёток в растущих ооцитах T. scripta 45
4.2 Ядрышки в растущих ооцитах T. scripta 46
Выводы 49
Список литературы 50
Благодарности
1. Обзор литературы 7
1.1 Хромосомы типа ламповых щёток 7
1.2 Внутриядерные тельца: Ядрышки 11
1.3 Другие внутриядерные тельца 15
1.4 Кариотип Trachemys scripta 16
1.5 Оогенез Trachemys scripta 17
1.6 Биоинформатический обзор IGS 19
2. Материал и методы 22
2.1 Объект исследования 22
2.2 Фиксация тканей 22
2.3 Замораживание образцов 22
2.4 Приготовление криосрезов и отбор препаратов для исследования 22
2.5 Предподготовка или постфиксация препаратов для FISH или ИГХ 23
2.6 Зонд к последовательности 5' ETS рибосомного кластера 23
2.7 FISH на криосрезах яичников 24
2.8 Детекция сигнала FISH с помошью ИГХ 25
2.9 Иммуногистохимия 26
2.10 Использованные антитела 26
2.11 Красители и флуоресцентные метки 27
2.12 Препараты изолированных из ооцитов ядер и хромосом типа ЛЩ 27
2.13 Окраска изолированных ядер 28
2.14 Микроскопия 28
2.15 Программное обеспечение для анализа снимков и их обработки 28
3. Результаты 29
3.1 Общая морфология ядра в растущих ооцитах T. scripta 29
3.2 Характеристика хромосом в растущих ооцитах 30
3.3 Цитологические карты макрохромосом и микрохромосом 37
3.4 Нуклеолярный аппарат в растущих ооцитах T. scripta 39
3.5 Анализ транскрипционной активности рибосомных генов 41
3.6 Биоинформатический анализ последовательности IGS 43
4. Обсуждение 45
4.1 Хромосомы типа ламповых щёток в растущих ооцитах T. scripta 45
4.2 Ядрышки в растущих ооцитах T. scripta 46
Выводы 49
Список литературы 50
Благодарности
Растущие ооциты представляют собой высокоспециализированные клетки, в цитоплазме которых аккумулируются и запасаются огромные количества органелл, макромолекул и других энергоемких соединений, необходимых для осуществления ранних этапов эмбрионального развития. Разнообразие источников материнских РНК в значительной степени определяет огромное разнообразие способов развития женской половой клетки (Равен, 1964; Davidson, 1986; цит. по Koshel et al., 2016; Дондуа, 2005). Так, высокая транскрипционная активность хромосом, преобразованных в ламповые щетки, и амплификация рибосомных генов с образованием множества экстрахромосомных ядрышек характеризуют гипертранскрипционный тип оогенеза у представителей рыб, амфибий и ряда, низших вторичноротых (по Дондуа, 2005). Как известно, оогенез птиц и млекопитающих, в отличие от низших позвоночных, не сопровождается амплификацией рибосомных генов в ядрышковом аппарате (Koshel et al., 2016), при этом в растущих ооцитах птиц хромосомы преобразуются в хорошо развитые и транскрипционно активные ламповые щетки (Gaginskaya et al., 2009). Среди позвоночных, особенности организации и функционирования генетического аппарата в ходе оогенеза наиболее слабо изучены у представителей класса Reptilia. Результаты в основном получены с использованием гистологических подходов, в то время как современные данные по функциональной морфологии и макромолекулярному составу ядерных структур практически отсутствуют.
Рептилии, или пресмыкающиеся, представляют класс животных, в котором 3 отряда (Crocodilia - Крокодилы, Squamata - Чешуйчатые и Testudines - Черепахи) эволюционировали независимо друг от друга. Соответственно, можно предположить, что представители класса пресмыкающихся, отличаются между собой в особенностях гаметогенеза. Как пример можно привести отличия во взаимоотношениях фоликулярных клеток и растущих ооцитов (Andreuccetti et al., 1978; Rahil et al., 1973). Известны данные о различиях в функциональной активности нуклеолярного аппарата между ящерицами (Arronet, 1973; Lutes et al, 2010) и черепахами и крокодилами (Callebaut et al., 1997; Calderon et al., 2004). Наш выбор в качестве объекта представителя американских пресноводных черепах красноухой черепахи Trachemys scripta (сем. Emydidae, отр. Testudines) определялся следующими причинами. Во-первых, черепахи, наряду с крокодилами, филогенетически ближе к птицам, оогенез которых традиционно исследуется в лаборатории структуры и функции хромосом Санкт-Петербургского государственного университета; во-вторых, в интернете доступны данные о расшифрованном геноме сестринского вида - бугорчатой черепахи Malaclemys terrapin и «сырые» последовательности из генома T. Scripta; в-третьих, эта черепаха легкодоступна для приобретения у заводчиков и проще для содержания в неволе по сравнению с другими видами рептилий (например, крокодилами).
Для изучения организации ядра и ядерных структур в ооцитах красноухой черепахи T. scripta мы применяли специфические для нуклеиновых кислот флуорохромы, иммунофлуоресцентную микроскопию с антителами против маркерных белков ядрышка, а также флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) с ДНК-зондом 5’ETS (транскрибируемый спейсер на 5’-конце кластера генов рРНК) данного вида. Таким образом, в работе использованы методы приготовления криосрезов, эпифлуоресцентной микроскопии, иммуногистохимии, молекулярной гибридизации in situ (FISH) и биоинформатический анализ.
Целью настоящей работы было изучение функциональной организации ядра и ядерных структур в растущих ооцитах красноухой черепахи Trachemys scripta. Для достижения этой цели были сформулированы следующие конкретные задачи:
1. Охарактеризовать общую организацию ядра в растущих ооцитах T. scripta на основе SD-анализа изолированных из ооцитов ядер с использованием конфокальной микроскопии.
2. Описать детали организации хромосом в растущих ооцитах у половозрелых самок T. scripta на основе исследования препаратов содержимого изолированных из ооцитов ядер с использованием эпифлуоресцентной микроскопии.
3. Охарактеризовать особенности нуклеолярного аппарата в растущих ооцитах T. scripta на основе флуоресцентного иммуногистохимического анализа криосрезов яичников.
4. Проанализировать транскрипционную активность рибосомных генов методом ДНК-РНК FISH с ДНК зондом к 5’ ETS.
5. Провести биоинформатический анализ последовательности межгенного спейсера (IGS) в рибосомной ДНК T. scripta и оценить наличие в нем повторяющихся элементов. Полученные в работе результаты были частично представлены на Конференции с международным участием «Клеточная биология: проблемы и перспективы», Санкт- Петербург, 2-5 октября 2017 г.
Рептилии, или пресмыкающиеся, представляют класс животных, в котором 3 отряда (Crocodilia - Крокодилы, Squamata - Чешуйчатые и Testudines - Черепахи) эволюционировали независимо друг от друга. Соответственно, можно предположить, что представители класса пресмыкающихся, отличаются между собой в особенностях гаметогенеза. Как пример можно привести отличия во взаимоотношениях фоликулярных клеток и растущих ооцитов (Andreuccetti et al., 1978; Rahil et al., 1973). Известны данные о различиях в функциональной активности нуклеолярного аппарата между ящерицами (Arronet, 1973; Lutes et al, 2010) и черепахами и крокодилами (Callebaut et al., 1997; Calderon et al., 2004). Наш выбор в качестве объекта представителя американских пресноводных черепах красноухой черепахи Trachemys scripta (сем. Emydidae, отр. Testudines) определялся следующими причинами. Во-первых, черепахи, наряду с крокодилами, филогенетически ближе к птицам, оогенез которых традиционно исследуется в лаборатории структуры и функции хромосом Санкт-Петербургского государственного университета; во-вторых, в интернете доступны данные о расшифрованном геноме сестринского вида - бугорчатой черепахи Malaclemys terrapin и «сырые» последовательности из генома T. Scripta; в-третьих, эта черепаха легкодоступна для приобретения у заводчиков и проще для содержания в неволе по сравнению с другими видами рептилий (например, крокодилами).
Для изучения организации ядра и ядерных структур в ооцитах красноухой черепахи T. scripta мы применяли специфические для нуклеиновых кислот флуорохромы, иммунофлуоресцентную микроскопию с антителами против маркерных белков ядрышка, а также флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) с ДНК-зондом 5’ETS (транскрибируемый спейсер на 5’-конце кластера генов рРНК) данного вида. Таким образом, в работе использованы методы приготовления криосрезов, эпифлуоресцентной микроскопии, иммуногистохимии, молекулярной гибридизации in situ (FISH) и биоинформатический анализ.
Целью настоящей работы было изучение функциональной организации ядра и ядерных структур в растущих ооцитах красноухой черепахи Trachemys scripta. Для достижения этой цели были сформулированы следующие конкретные задачи:
1. Охарактеризовать общую организацию ядра в растущих ооцитах T. scripta на основе SD-анализа изолированных из ооцитов ядер с использованием конфокальной микроскопии.
2. Описать детали организации хромосом в растущих ооцитах у половозрелых самок T. scripta на основе исследования препаратов содержимого изолированных из ооцитов ядер с использованием эпифлуоресцентной микроскопии.
3. Охарактеризовать особенности нуклеолярного аппарата в растущих ооцитах T. scripta на основе флуоресцентного иммуногистохимического анализа криосрезов яичников.
4. Проанализировать транскрипционную активность рибосомных генов методом ДНК-РНК FISH с ДНК зондом к 5’ ETS.
5. Провести биоинформатический анализ последовательности межгенного спейсера (IGS) в рибосомной ДНК T. scripta и оценить наличие в нем повторяющихся элементов. Полученные в работе результаты были частично представлены на Конференции с международным участием «Клеточная биология: проблемы и перспективы», Санкт- Петербург, 2-5 октября 2017 г.
Подводя итог, в соответствии с поставленными задачами, были сделаны определённые выводы:
1. Ядро растущего ооцита Trachemys scripta на стадии ламповых щёток имеет сложную морфологию и содержит большое количество экстрахромосомных ДНК-РНК содержащих телец разных размеров.
2. Все хромосомы в растущих ооцитах красноухой черепахи преобразуются в типичные ламповые щётки с характерным хромомерно-петлевым строением.
3. В оогенезе T. scripta происходит амплификация рибосомных генов с образованием множественных экстрахромосомных ядрышек, активно транскрибируюших пре-рРНК.
4. Многочисленные РНК-содержащие тельца в ядрах растущих ооцитов красноухой черепахи, представляют собой типичные ядрышки, обогащённые маркерным белком нуклеолином.
5. В рибосомных повторах генома Trachemys scripta, межгенный спейсер (IGS) значительно короче и гораздо менее сложно организован, чем IGS у эволюционно близкой группы Aves, а также IGS красноухой черепахи более схож по структуре повторов с IGS амфибий.
Соответственно, на основе данных литературы и собственного исследования мы пришли к заключению, что ядро в растущем ооците черепахи по своей функциональной морфологии более схоже с ядром в растущих ооцитах представителей класса Amphibia, чем в ооцитах домашней курицы, относящейся к эволюционно более близкому рептилиям классу Aves.
1. Ядро растущего ооцита Trachemys scripta на стадии ламповых щёток имеет сложную морфологию и содержит большое количество экстрахромосомных ДНК-РНК содержащих телец разных размеров.
2. Все хромосомы в растущих ооцитах красноухой черепахи преобразуются в типичные ламповые щётки с характерным хромомерно-петлевым строением.
3. В оогенезе T. scripta происходит амплификация рибосомных генов с образованием множественных экстрахромосомных ядрышек, активно транскрибируюших пре-рРНК.
4. Многочисленные РНК-содержащие тельца в ядрах растущих ооцитов красноухой черепахи, представляют собой типичные ядрышки, обогащённые маркерным белком нуклеолином.
5. В рибосомных повторах генома Trachemys scripta, межгенный спейсер (IGS) значительно короче и гораздо менее сложно организован, чем IGS у эволюционно близкой группы Aves, а также IGS красноухой черепахи более схож по структуре повторов с IGS амфибий.
Соответственно, на основе данных литературы и собственного исследования мы пришли к заключению, что ядро в растущем ооците черепахи по своей функциональной морфологии более схоже с ядром в растущих ооцитах представителей класса Amphibia, чем в ооцитах домашней курицы, относящейся к эволюционно более близкому рептилиям классу Aves.