Тема: Разработка ПЦР-системы для определения уровней экспрессии интерферонов мыши
Закажите новую по вашим требованиям
Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
📋 Содержание
2. Обзор литературы.
2.1 Система интерферонов
2.2 Интерфероны первого типа(IFN I)
2.2.1 Особенности интерферонов первого типа.
2.2.2 Активация транскрипции
2.2.3 Регуляция транскрипции
2.2.4 Действие интерферонов первого типа на клетку......................................12
2.3 Интерфероны второго типа (IFN II
2.3.1 Особенности интерферонов второго типа
2.3.2 Активация транскрипции
2.3.3 Регуляция транскрипции
2.3.4 Действие интерферонов второго типа на клетку
2.4 Интерфероны третьего типа (IFN III)
2.4.1 Особенности интерферонов третьего типа
2.4.2 Активация транскрипции
2.4.3 Регуляция транскрипции
2.4.4 Действие интерферонов третьего типа на клетку.
3. Материалы и методы.
3.1 Материалы
3.1.1 Органы мыши линии BALB/c.
3.1.2 Лимфоциты селезенки мыши BALB/c
3.2 Экстракция РНК
3.3 Обратная транскрипция
3.4 ПЦР в режиме реального времени
3.5 Разделение фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.....23
4. Результаты и обсуждение
4.1 Дизайн праймеров и зондов.
4.2 Проверка качества выделенной тотальной РНК из органов мыши ..............26
4.3 Тестирование праймеров на специфичность
4.4 Проверка зондов и праймеров на чувствительность и специфичность в
моноплексном анализе.
4.5 Оптимизация условий проведения мультиплексной ПЦР для определения
уровней экспрессии интерферонов мыши
5. Заключение
6. Основные выводы
7. Список литературы.
📖 Введение
На сегодняшний день описано свыше 300 различных эффектов интерферонов, включающих подавление роста внутриклеточных и внеклеточных инфекционных агентов вирусной и невирусной природы; антипролиферативную активность; индукцию противоопухолевого ответа; подавление или усиление продукции антител; стимуляцию макрофагов; усиление фагоцитоза; активацию цитотоксического действия сенсибилизированных лимфоцитов на клетки-мишени; активацию натуральных киллеров; стимуляцию освобождения гистамина базофилами; индукцию синтеза простагландина Е; усиление презентации по механизму MHC I и II классов; усиление или ингибирование активностей ряда клеточных ферментов; усиление цитотоксического действия двухнитевых РНК; подавление гиперчувствительности замедленного типа; стимуляцию выработки молекул адгезии (Ершов Ф.И., 2012).
Такое многообразие физиологических функций позволяет рассматривать интерфероны как отдельное звено – систему интерферонов, выполняющую контрольнорегулирующую роль в сохранении гомеостаза. Экспрессия генов интерферонов в основном не является конститутивной, а индуцируется в клетке в ответ на внедрение вирусов и бактерий (или их продуктов). Изучение уровней экспрессии генов, относящихся к системе интерферонов, позволит, например, исследовать состоятельность иммунного ответа при инфицировании вирусами, оценить иммуногенность и реактогенность вакцинных препаратов, проследить формирование специфического клеточноопосредованного ответа. Таким образом, разработка ПЦР-системы для детекции интерферонов мыши на уровне транскрипции является актуальной задачей, позволяющей расширить методы молекулярной диагностики интерферонов, в настоящее время преимущественно ограниченной ИФА.
Цель исследования состояла в создании ПЦР-системы, позволяющей достоверно оценивать уровни экспрессии генов интерферонов в организме мыши.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
1) Провести дизайн праймеров и зондов, специфически выявляющих интерферональфа, интерферон-бета, интерферон-гамма и интерферон-лямбда в организме мыши;5
2) Выделить препараты тотальной РНК из органов мыши без примеси ДНК;
3) Получить препараты кДНК из органов мыши для отработки условий ПЦР;
4) Проверить специфичность подобранных праймеров и зондов;
5) Оценить эффективность амплификации специфических мишеней в моноплексном и мультиплексном форматах ПЦР.
✅ Заключение
эндогенного контроля, используемого для нормализации. Параллельное определение сразу двух мишеней (одного из интерферонов и гена-референса) в одной реакции повышает точность разработанной ПЦР-системы. Подобный дизайн ПЦР-системы также позволяет уменьшить расход образца и добиться воспроизводимых результатов.
С использованием программы Vector NTI Advance 11 был проведен дизайн праймеров и олигонуклеотидных зондов, специфически выявляющих интерфероны мыши.
Для IFNγ и IFNλ были подобраны праймеры, позволяющие детерминировать геномную ДНК и кДНК. Зонды и праймеры для IFNλ позволяют одновременно детектировать два транскрипционных варианта гена. Для определения экспрессии IFNα были разработаны вырожденные праймеры и два олигонуклеотидных зонда, одновременно выявляющие 14 существующих у мыши субтипов интерферонов.
Специфичность полученных праймеров была подтверждена методом ПЦР с последующей детекцией продуктов методом электрофоретического разделения в агарозном геле. Все подобранные праймеры образуют целевой, предсказанный in silico продукт, без образования димеров праймеров и зонда.
Были оптимизированы соотношения праймеров для каждой мишени, а также рассчитаны эффективности амплификации специфических продуктов с использованием серии последовательных десятикратных разведений кДНК. Рассчитанные эффективности амплификации свыше 95 % и отличаются друг от друга в каждом наборе реакций не более чем на 5 %.
При выполнении дипломной работы были освоены такие основные методы, используемые в молекулярно-биологической лаборатории, как выделение лимфоцитарной фракции из селезенки мыши, экстракция препаратов тотальной РНК из органов мыши, электрофоретическое разделение РНК в агарозном геле, получение кДНК методом обратной транскрипции, постановка ПЦР с детекцией в режиме реального времени, электрофоретическое разделение продуктов ПЦР. Получены навыки дизайна праймеров и олигонуклеотидных Taq-Man зондов.38
В заключение следует отметить, что хотя предложенная ПЦР-система изначально была разработана для определения уровней экспрессии интерферонов в организме мыши при гриппе, она может быть применена при проведении более широкого круга биологических исследований, проводимых с использованием этой животной модели.
В дальнейшем планируется продолжить представленную выпускную квалификационную работу и с использованием разработанной ПЦР-системы сравнить уровни экспрессии интерферонов в легких, селезенке и печени инфицированных и интактных мышей.



