I. ВВЕДЕНИЕ, ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ 6
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1. Стресс 7
2. Апоптоз 8
2.1 Ключевые стадии в сигнальных путях апоптоза 9
2.2 Внутренний путь 9
2.3 Внешний путь 9
3. Клеточное старение 11
3.1 Арест клеточного цикла 11
3.2 Стресс-индуцированная форма старения 12
4. Взаимосвязь между апоптозом и клеточным старением 13
5. Р53 - центральный регулятор клеточного ответа на стресс 14
5.1 Регуляция белка p53 14
5.2 Ацетилирование и метилирование белка p53 15
5.3 Метилтранферазы p53 и механизм метилирования 16
5.4 Мезенхимные стволовые клетки человека 18
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 20
1. Клеточная линия и особенности культивирования клеток 20
2. Моделирование окислительного стресса и условия обработки клеток 20
3. Электрофорез и иммуноблотинг 20
3.1 Приготовление проб для электрофоретического разделения 20
3.2 Электрофорез белков в полиакриламидном геле 21
3.3 Иммуноблотинг со специфическими антителами 21
4. Молекулярное клонирование и сборка лентивирусных частиц для генетической
модификации клеток 22
4.1 Трансформация компетентных бактерий методом теплового шока и
накопление плазмиды 22
4.2 Выделение ДНК 22
4.3 Очистка выделенной ДНК смесью фенол-хлороформ-изобутиловый спирт...23
4.4 Электрофорез ДНК в агарозном геле 23
4.5 Трансфекция пакующих клеток HEK293T 24
5. Трансдукция клеточной линии эЭМК лентивирусными векторами и получение
культуры с нокаутом гена setd7 25
5.1 Используемая конструкция и вектор 25
5.2 Трансдукция клеточной линии эМСК и последующая селекция 26
6. Метод проточной цитофлуориметрии 27
6.1 Анализ изменения размера и количества клеток 27
6.2 Анализ апоптотических клеток, окрашенных с помощью йодида пропидия и
Annexin V/FITC 27
7. Статистическая обработка данных 28
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 29
1. Экспрессия Set7/9 в мезенхимных стволовых клетках линии 2804 в условиях
окислительного стресса 29
2. Нокаут гена setd7, кодирующего метилтранферазу Set7/9 в клетках эМСК 30
3. Сравнение кривых роста клеток эМСК и мутантных эМСК со сниженным уровнем
метилтрансферазы Set7/9 31
4. Активация p53/p21 и p16/pRb сигнальных путей клеточного старения в мутантных
клетках эМСК со сниженным уровнем метилтрансферазы Set7/9 33
5. Характер ответа на активацию апоптоза в клетках эМСК со сниженным уровнем
метилтрансферазы Set7/9 35
V. ВЫВОДЫ 39
VI. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 40
Белок p53 является центральным регулятором клеточного ответа на стресс, через активацию клеточного старения или процесса программируемой клеточной смерти - апоптоза. Регуляция активности белка p53 осуществляется на различных уровнях, в том числе посредством конформационных изменений в ходе посттрансляционных модификаций. Относительно недавно, было отмечено, что одним из необходимых регуляторов активности белка p53 является метилтрансфераза Set7/9. Большая часть исследований данной функции метилтрансферазы было сделано на культурах раковых клеток в экспериментах по изучению онкогенной активности при нарушении метилирования белка p53. Лишь небольшая часть работ посвящена вовлечённости Set7/9 в процессы, связанные с реакцией клеток на стресс. Основные данные, свидетельствующие о критической роли Set7/9 в активации клеточного ответа на стресс были также получены на культурах раковых клеток. В противовес данным результатам проведён ряд исследований на культурах здоровых клеток человека и на мышах in vivo, утверждающих об отсутствии вклада Set7/9 в регуляцию белка p53. В том числе отсутствуют данные о роли Set7/9 в стволовых клетках человека, участвующих в регенерации тканей.
Таким образом, целью исследования является установление роли метилтрансферазы Set7/9 в реакции эндометриальных стволовых клеток человека на окислительный стресс.
Для этого было предложено решить следующие задачи:
1. Получить линию эндометриальных мезенхимальных стволовых клеток человека с нокаутом гена setd7, кодирующего метилтрансферазу Set7/9.
2. Оценить уровень экспрессии гена метилтранферазы Set7/9 по мере развития Н2О2- индуцированного стресса.
3. Оценить влияние метилтрансферазы Set7/9 на активацию старения через сигнальный путь p53/p21/pRb в условиях сублетальных доз Н2О2.
4. Оценить влияния метилтрансферазы Set7/9 на процесс активации апоптоза в условиях летальной дозы Н2О2.
ВЫВОДЫ
1. По мере развития Н2О2-индуцированного стресса в культуре эМСК наблюдается устойчивая экспрессия гена метилтрансферазы Set7/9.
2. При нокаутировании гена setd7 в культуре наблюдается снижение продукта экспрессии гена, однако получение чистой линии эМСК с нокаутом гена setd7 не представляется возможным.
3. Метилтрансфераза Set7/9 не оказывает влияния на активацию процесса клеточного старения через сигнальные пути p53/p21 и p16/pRb в условиях сублетальной дозы Н2О2 (200 мкМ).
4. Метилтрансфераза Set7/9 не оказывает влияния на процесс активации и развития апоптоза в условиях летальных доз Н2О2 на ранних сроках.
5. Недостаток метилтрансферазы Set7/9 оказывает негативное влияние на выживаемость клеток на поздних стадиях развития апоптоза в условиях летальных доз Н2О2.
