Конструирование прокариотических систем экспрессии генов, кодирующих протективные антигены Mycobacterium tuberculosis

Список сокращений 4
1. ВВЕДЕНИЕ 6
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
2.1 Туберкулез как заболевание 8
2.2. Эпидемиология туберкулеза 10
2.3. Характеристика M. tuberculosis 11
2.4. Патогенез туберкулеза 12
2.5. Диагностика туберкулеза 14
2.6. Вакцина БЦЖ (BCG, Bacillus Calmette - Guerin) 16
2.7. Стратегия разработки новых вакцин 18
2.8. Разработка новых вакцин 19
2.8.1. Вакцинные кандидаты на основе живых модифицированных штаммов Mycobacterium bovis 19
2.8.2. Вакцинные кандидаты на основе живых аттенуированных штаммов M. tuberculosis 20
2.8.3. ДНК-вакцины 21
2.8.4. Вакцинные кандидаты на основе рекомбинантных вирусных векторов 22
2.8.5. Вакцинные кандидаты на основе рекомбинантных белков 23
2.9. Антигены M. tuberculosis 25
2.9.1. ESAT-6 26
2.9.2. TB 10.4 27
2.9.3. Heat shock protein X (Hsp X) 28
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 29
2.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 29
2.2 Горизонтальный электрофорез ДНК 30
2.3 Очистка ПЦР-продукта из амплификационной смеси 30
2.4 Реакция рестрикции ДНК 30
2.5 Выделение ПЦР-фрагментов из агарозного геля 30
2.6 Получение рекомбинантных плазмид 30
2.7 Среды 30
2.8 Штаммы бактерий 30
2.9 Получение электрокомпетентных клеток 31
2.10 Трансформация бактериальных клеток 31
2.11 Культивирование трансформантов E. coli. 31
2.12 Отбор клонов с рекомбинантной ДНК 31
2.13 Выделение плазмидной ДНК 31
2.14 Cеквенирование 32
2.15 Индукция экспрессии рекомбинантных генов 32
2.16 Электрофорез белков 32
2.17 Выделение телец включения 32
2.18 Хроматографическая очистка и рефолдинг целевых белков 33
2.19 Вестерн-блоттинг белков 34
2.20 Подготовка спленоцитов мышей к анализу на проточном цитометре 34
2.21 Тактика «гейтирования» 35
3. РЕЗУЛЬТАТЫ 37
3.1 Конструирование рекомбинантных экспрессионных плазмид 37
3.2 Экспрессия рекомбинантных генов в клетках штамма E. coli Rosetta™ (DE3) 42
3.3 Очистка гибридных белков GST-HspX, GST-ESAT-6, GST-TB10.4 46
3.4 Вестерн-блоттинг гибридных белков GST-TB10.4 и GST-HspX 48
3.5 Изучение антигенных свойств гибридных белков in vitro. Специфическое взаимодействие с антителами к M.tuberculosis 49
3.6. Использование гибридных белков в качестве специфических индукторов при проведении исследований клеточного иммунитета 54
4. ОБСУЖДЕНИЕ 58
5. ВЫВОДЫ 61
6. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 62
7. ПРИЛОЖЕНИЯ 70
Купить

Туберкулез (ТБ) - одно из самых распространенных заболеваний в мире, которое вызывается некоторыми видами рода Mycobacterium. Самым распространенным патогеном, вызывающим туберкулез у человека является Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis'). Чаще всего при туберкулезе поражаются легкие, а также могут быть поражены органы центральной нервной системы, лимфатической системы, системы кровообращения и мочеполовой системы (Orme, 2015).
По данным ВОЗ, ежегодно туберкулезом заболевают не менее 10,4 млн. человек и 1,3 млн. умирают от этой болезни (в том числе 374 000 смертей среди больных ВИЧ). Устойчивость микобактерий ко многим лекарственным препаратам является глобальной проблемой при борьбе с туберкулезом. Так, в 2016 году обнаружено около 600 000 случаев инфицирования людей микобактериями, устойчивыми к рифампицину (основной антибиотик, применяемый при лечении туберкулеза). В 490 000 случаев туберкулез был вызван микобактериями, устойчивыми к целому ряду лекарственных препаратов (микобактерии туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ M. tuberculosis')}. Почти половина (47%) из этих случаев приходится всего на 3 страны: Индия, Китай, Российская Федерация. Ежегодно на лечение и профилактику туберкулеза расходуется в мире около 2,3 млрд. долларов США (WHO, 2017).
На данный момент существует только одна вакцина, которая применяется для профилактики туберкулеза во всем мире - вакцина БЦЖ (BCG, Bacillus Calmette-Guerin), которая была получена в начале XX века на основе вирулентного штамма Mycobacterium bovis.
Следует отметить, что применение этой вакцины эффективно для защиты от инфицирования патогенными штаммами M. tuberculosis только для младенцев и детей младшего возраста, и не рекомендуется взрослым и пациентам пожилого возраста из-за ряда причин, например, таких как низкая эффективность вакцины против легочного туберкулеза для взрослых (Orme, 2010). Помимо этого, защитный эффект вакцины может полностью отсутствовать спустя 7 лет после вакцинации (Russell, Barry and Flynn, 2010).
В настоящее время предпринимаются различные подходы конструирования новых вакцин для вакцинопрофилактики, бустирования (усиление иммунного ответа за счет ревакцинации) и вакцинотерапии.
В ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России проводится работа по созданию вакцинных кандидатов для профилактики туберкулеза на основе гриппозных векторов, несущих различные гены, кодирующие протективные (вызывающие защитный иммунный ответ) белки M. tuberculosis. По результатам доклинических исследований на моделях экспериментального туберкулеза, наибольшими протективными свойствами обладают гриппозные векторы, несущие гены, кодирующие белки ESAT-6, TB10.4 и HspX в различных сочетаниях. Известно, что вирусный вектор способен формировать стойкий антиген-специфичный CD8+ T-клеточный иммунный ответ за счет внутриклеточной экспрессии микобактериальных генов, а субъединичная вакцина способна вызывать CD4+ Т-клеточный иммунный ответ. Последовательное применение двух типов вакцинных кандидатов в режиме «prime-boost» может индуцировать продолжительный защитный эффект против туберкулеза за счет стимуляции основных звеньев клеточного иммунитета.
Данная работа посвящена получению и характеристике белков M. tuberculosis с целью дальнейшего исследования их вакцинного потенциала in vivo, а также их использования для диагностики туберкулезной инфекции.
Целью настоящей работы является получение гибридных белков M. tuberculosis GST-ESAT-6, GST-TB10.4 и GST-HspX в бактериальной экспрессионной системе и характеристика их антигенных свойств.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Сконструировать экспрессионные плазмиды для наработки препарата белков M. tuberculosis GST-ESAT-6, GST-TB10.4 и GST-HspX.
2. Создать штаммы-продуценты гибридных белков GST-ESAT-6, GST-TB10.4 и GST-HspX M. tuberculosis на основе штамма E. coli.
3. Изучить антигенные свойства полученных гибридных белков.
Купить