📄Работа №130524
Тема: Конструирование прокариотических систем экспрессии генов, кодирующих протективные антигены Mycobacterium tuberculosis
Тип работы
Магистерская диссертация
Предмет
биотехнология
Объем:
73 листов
Год:
2018
Просмотров:
135
5400
руб.
🛒 Купить работу
Не подходит эта работа?
Закажите новую по вашим требованиям
Узнать цену на написание
Закажите новую по вашим требованиям
Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
📋 Содержание
Список сокращений 4
1. ВВЕДЕНИЕ 6
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
2.1 Туберкулез как заболевание 8
2.2. Эпидемиология туберкулеза 10
2.3. Характеристика M. tuberculosis 11
2.4. Патогенез туберкулеза 12
2.5. Диагностика туберкулеза 14
2.6. Вакцина БЦЖ (BCG, Bacillus Calmette - Guerin) 16
2.7. Стратегия разработки новых вакцин 18
2.8. Разработка новых вакцин 19
2.8.1. Вакцинные кандидаты на основе живых модифицированных штаммов Mycobacterium bovis 19
2.8.2. Вакцинные кандидаты на основе живых аттенуированных штаммов M. tuberculosis 20
2.8.3. ДНК-вакцины 21
2.8.4. Вакцинные кандидаты на основе рекомбинантных вирусных векторов 22
2.8.5. Вакцинные кандидаты на основе рекомбинантных белков 23
2.9. Антигены M. tuberculosis 25
2.9.1. ESAT-6 26
2.9.2. TB 10.4 27
2.9.3. Heat shock protein X (Hsp X) 28
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 29
2.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 29
2.2 Горизонтальный электрофорез ДНК 30
2.3 Очистка ПЦР-продукта из амплификационной смеси 30
2.4 Реакция рестрикции ДНК 30
2.5 Выделение ПЦР-фрагментов из агарозного геля 30
2.6 Получение рекомбинантных плазмид 30
2.7 Среды 30
2.8 Штаммы бактерий 30
2.9 Получение электрокомпетентных клеток 31
2.10 Трансформация бактериальных клеток 31
2.11 Культивирование трансформантов E. coli. 31
2.12 Отбор клонов с рекомбинантной ДНК 31
2.13 Выделение плазмидной ДНК 31
2.14 Cеквенирование 32
2.15 Индукция экспрессии рекомбинантных генов 32
2.16 Электрофорез белков 32
2.17 Выделение телец включения 32
2.18 Хроматографическая очистка и рефолдинг целевых белков 33
2.19 Вестерн-блоттинг белков 34
2.20 Подготовка спленоцитов мышей к анализу на проточном цитометре 34
2.21 Тактика «гейтирования» 35
3. РЕЗУЛЬТАТЫ 37
3.1 Конструирование рекомбинантных экспрессионных плазмид 37
3.2 Экспрессия рекомбинантных генов в клетках штамма E. coli Rosetta™ (DE3) 42
3.3 Очистка гибридных белков GST-HspX, GST-ESAT-6, GST-TB10.4 46
3.4 Вестерн-блоттинг гибридных белков GST-TB10.4 и GST-HspX 48
3.5 Изучение антигенных свойств гибридных белков in vitro. Специфическое взаимодействие с антителами к M.tuberculosis 49
3.6. Использование гибридных белков в качестве специфических индукторов при проведении исследований клеточного иммунитета 54
4. ОБСУЖДЕНИЕ 58
5. ВЫВОДЫ 61
6. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 62
7. ПРИЛОЖЕНИЯ 70
1. ВВЕДЕНИЕ 6
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
2.1 Туберкулез как заболевание 8
2.2. Эпидемиология туберкулеза 10
2.3. Характеристика M. tuberculosis 11
2.4. Патогенез туберкулеза 12
2.5. Диагностика туберкулеза 14
2.6. Вакцина БЦЖ (BCG, Bacillus Calmette - Guerin) 16
2.7. Стратегия разработки новых вакцин 18
2.8. Разработка новых вакцин 19
2.8.1. Вакцинные кандидаты на основе живых модифицированных штаммов Mycobacterium bovis 19
2.8.2. Вакцинные кандидаты на основе живых аттенуированных штаммов M. tuberculosis 20
2.8.3. ДНК-вакцины 21
2.8.4. Вакцинные кандидаты на основе рекомбинантных вирусных векторов 22
2.8.5. Вакцинные кандидаты на основе рекомбинантных белков 23
2.9. Антигены M. tuberculosis 25
2.9.1. ESAT-6 26
2.9.2. TB 10.4 27
2.9.3. Heat shock protein X (Hsp X) 28
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 29
2.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 29
2.2 Горизонтальный электрофорез ДНК 30
2.3 Очистка ПЦР-продукта из амплификационной смеси 30
2.4 Реакция рестрикции ДНК 30
2.5 Выделение ПЦР-фрагментов из агарозного геля 30
2.6 Получение рекомбинантных плазмид 30
2.7 Среды 30
2.8 Штаммы бактерий 30
2.9 Получение электрокомпетентных клеток 31
2.10 Трансформация бактериальных клеток 31
2.11 Культивирование трансформантов E. coli. 31
2.12 Отбор клонов с рекомбинантной ДНК 31
2.13 Выделение плазмидной ДНК 31
2.14 Cеквенирование 32
2.15 Индукция экспрессии рекомбинантных генов 32
2.16 Электрофорез белков 32
2.17 Выделение телец включения 32
2.18 Хроматографическая очистка и рефолдинг целевых белков 33
2.19 Вестерн-блоттинг белков 34
2.20 Подготовка спленоцитов мышей к анализу на проточном цитометре 34
2.21 Тактика «гейтирования» 35
3. РЕЗУЛЬТАТЫ 37
3.1 Конструирование рекомбинантных экспрессионных плазмид 37
3.2 Экспрессия рекомбинантных генов в клетках штамма E. coli Rosetta™ (DE3) 42
3.3 Очистка гибридных белков GST-HspX, GST-ESAT-6, GST-TB10.4 46
3.4 Вестерн-блоттинг гибридных белков GST-TB10.4 и GST-HspX 48
3.5 Изучение антигенных свойств гибридных белков in vitro. Специфическое взаимодействие с антителами к M.tuberculosis 49
3.6. Использование гибридных белков в качестве специфических индукторов при проведении исследований клеточного иммунитета 54
4. ОБСУЖДЕНИЕ 58
5. ВЫВОДЫ 61
6. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 62
7. ПРИЛОЖЕНИЯ 70
📖 Введение
Туберкулез (ТБ) - одно из самых распространенных заболеваний в мире, которое вызывается некоторыми видами рода Mycobacterium. Самым распространенным патогеном, вызывающим туберкулез у человека является Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis'). Чаще всего при туберкулезе поражаются легкие, а также могут быть поражены органы центральной нервной системы, лимфатической системы, системы кровообращения и мочеполовой системы (Orme, 2015).
По данным ВОЗ, ежегодно туберкулезом заболевают не менее 10,4 млн. человек и 1,3 млн. умирают от этой болезни (в том числе 374 000 смертей среди больных ВИЧ). Устойчивость микобактерий ко многим лекарственным препаратам является глобальной проблемой при борьбе с туберкулезом. Так, в 2016 году обнаружено около 600 000 случаев инфицирования людей микобактериями, устойчивыми к рифампицину (основной антибиотик, применяемый при лечении туберкулеза). В 490 000 случаев туберкулез был вызван микобактериями, устойчивыми к целому ряду лекарственных препаратов (микобактерии туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ M. tuberculosis')}. Почти половина (47%) из этих случаев приходится всего на 3 страны: Индия, Китай, Российская Федерация. Ежегодно на лечение и профилактику туберкулеза расходуется в мире около 2,3 млрд. долларов США (WHO, 2017).
На данный момент существует только одна вакцина, которая применяется для профилактики туберкулеза во всем мире - вакцина БЦЖ (BCG, Bacillus Calmette-Guerin), которая была получена в начале XX века на основе вирулентного штамма Mycobacterium bovis.
Следует отметить, что применение этой вакцины эффективно для защиты от инфицирования патогенными штаммами M. tuberculosis только для младенцев и детей младшего возраста, и не рекомендуется взрослым и пациентам пожилого возраста из-за ряда причин, например, таких как низкая эффективность вакцины против легочного туберкулеза для взрослых (Orme, 2010). Помимо этого, защитный эффект вакцины может полностью отсутствовать спустя 7 лет после вакцинации (Russell, Barry and Flynn, 2010).
В настоящее время предпринимаются различные подходы конструирования новых вакцин для вакцинопрофилактики, бустирования (усиление иммунного ответа за счет ревакцинации) и вакцинотерапии.
В ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России проводится работа по созданию вакцинных кандидатов для профилактики туберкулеза на основе гриппозных векторов, несущих различные гены, кодирующие протективные (вызывающие защитный иммунный ответ) белки M. tuberculosis. По результатам доклинических исследований на моделях экспериментального туберкулеза, наибольшими протективными свойствами обладают гриппозные векторы, несущие гены, кодирующие белки ESAT-6, TB10.4 и HspX в различных сочетаниях. Известно, что вирусный вектор способен формировать стойкий антиген-специфичный CD8+ T-клеточный иммунный ответ за счет внутриклеточной экспрессии микобактериальных генов, а субъединичная вакцина способна вызывать CD4+ Т-клеточный иммунный ответ. Последовательное применение двух типов вакцинных кандидатов в режиме «prime-boost» может индуцировать продолжительный защитный эффект против туберкулеза за счет стимуляции основных звеньев клеточного иммунитета.
Данная работа посвящена получению и характеристике белков M. tuberculosis с целью дальнейшего исследования их вакцинного потенциала in vivo, а также их использования для диагностики туберкулезной инфекции.
Целью настоящей работы является получение гибридных белков M. tuberculosis GST-ESAT-6, GST-TB10.4 и GST-HspX в бактериальной экспрессионной системе и характеристика их антигенных свойств.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Сконструировать экспрессионные плазмиды для наработки препарата белков M. tuberculosis GST-ESAT-6, GST-TB10.4 и GST-HspX.
2. Создать штаммы-продуценты гибридных белков GST-ESAT-6, GST-TB10.4 и GST-HspX M. tuberculosis на основе штамма E. coli.
3. Изучить антигенные свойства полученных гибридных белков.
По данным ВОЗ, ежегодно туберкулезом заболевают не менее 10,4 млн. человек и 1,3 млн. умирают от этой болезни (в том числе 374 000 смертей среди больных ВИЧ). Устойчивость микобактерий ко многим лекарственным препаратам является глобальной проблемой при борьбе с туберкулезом. Так, в 2016 году обнаружено около 600 000 случаев инфицирования людей микобактериями, устойчивыми к рифампицину (основной антибиотик, применяемый при лечении туберкулеза). В 490 000 случаев туберкулез был вызван микобактериями, устойчивыми к целому ряду лекарственных препаратов (микобактерии туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ M. tuberculosis')}. Почти половина (47%) из этих случаев приходится всего на 3 страны: Индия, Китай, Российская Федерация. Ежегодно на лечение и профилактику туберкулеза расходуется в мире около 2,3 млрд. долларов США (WHO, 2017).
На данный момент существует только одна вакцина, которая применяется для профилактики туберкулеза во всем мире - вакцина БЦЖ (BCG, Bacillus Calmette-Guerin), которая была получена в начале XX века на основе вирулентного штамма Mycobacterium bovis.
Следует отметить, что применение этой вакцины эффективно для защиты от инфицирования патогенными штаммами M. tuberculosis только для младенцев и детей младшего возраста, и не рекомендуется взрослым и пациентам пожилого возраста из-за ряда причин, например, таких как низкая эффективность вакцины против легочного туберкулеза для взрослых (Orme, 2010). Помимо этого, защитный эффект вакцины может полностью отсутствовать спустя 7 лет после вакцинации (Russell, Barry and Flynn, 2010).
В настоящее время предпринимаются различные подходы конструирования новых вакцин для вакцинопрофилактики, бустирования (усиление иммунного ответа за счет ревакцинации) и вакцинотерапии.
В ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России проводится работа по созданию вакцинных кандидатов для профилактики туберкулеза на основе гриппозных векторов, несущих различные гены, кодирующие протективные (вызывающие защитный иммунный ответ) белки M. tuberculosis. По результатам доклинических исследований на моделях экспериментального туберкулеза, наибольшими протективными свойствами обладают гриппозные векторы, несущие гены, кодирующие белки ESAT-6, TB10.4 и HspX в различных сочетаниях. Известно, что вирусный вектор способен формировать стойкий антиген-специфичный CD8+ T-клеточный иммунный ответ за счет внутриклеточной экспрессии микобактериальных генов, а субъединичная вакцина способна вызывать CD4+ Т-клеточный иммунный ответ. Последовательное применение двух типов вакцинных кандидатов в режиме «prime-boost» может индуцировать продолжительный защитный эффект против туберкулеза за счет стимуляции основных звеньев клеточного иммунитета.
Данная работа посвящена получению и характеристике белков M. tuberculosis с целью дальнейшего исследования их вакцинного потенциала in vivo, а также их использования для диагностики туберкулезной инфекции.
Целью настоящей работы является получение гибридных белков M. tuberculosis GST-ESAT-6, GST-TB10.4 и GST-HspX в бактериальной экспрессионной системе и характеристика их антигенных свойств.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Сконструировать экспрессионные плазмиды для наработки препарата белков M. tuberculosis GST-ESAT-6, GST-TB10.4 и GST-HspX.
2. Создать штаммы-продуценты гибридных белков GST-ESAT-6, GST-TB10.4 и GST-HspX M. tuberculosis на основе штамма E. coli.
3. Изучить антигенные свойства полученных гибридных белков.
✅ Заключение
ВЫВОДЫ
1. Гибридные белки GST-ESAT-6, GST-HspX и GST-TB10.4 способны вызывать формирование пула цитокин-продуцирующих СD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, инфицированных M. tuberculosis мышей;
2. Гибридные белки GST-ESAT-6, GST-HspX и GST-TB10.4 in vitro индуцируют продукцию цитокинов IFNy, IL-2 и TNFa T-лимфоцитами спленоцитов, выделенных из селезенок мышей, инфицированных M. tuberculosis.
3. Выявлены различия в характере иммуногенности гибридных белков GST-ESAT-6, GST-HspX и GST-TB10.4. Стимуляция Т-клеток гибридными белками GST-ESAT-6 и GST-TB10.4 индуцируют продукцию преимущественно IFNγ, тогда как гибридный бело GST-HspX приводит к формированию преимущественно TNFa-продуцирующих Т-лимфоцитов.
4. При детекции антител в сыворотках крови больных активной и латентной формой туберкулеза было показано, что гибридные белки GST-HspX, GST-TB 10.4 и GST-ESAT-6 специфически взаимодействуют с антителами к M. tuberculosis
5. Полученные гибридные белки могут быть использованы в качестве специфических индукторов при проведении иммунологических исследований, а также для дальнейшего изучения протективных свойств данных белков на моделях экспериментального туберкулеза.
1. Гибридные белки GST-ESAT-6, GST-HspX и GST-TB10.4 способны вызывать формирование пула цитокин-продуцирующих СD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, инфицированных M. tuberculosis мышей;
2. Гибридные белки GST-ESAT-6, GST-HspX и GST-TB10.4 in vitro индуцируют продукцию цитокинов IFNy, IL-2 и TNFa T-лимфоцитами спленоцитов, выделенных из селезенок мышей, инфицированных M. tuberculosis.
3. Выявлены различия в характере иммуногенности гибридных белков GST-ESAT-6, GST-HspX и GST-TB10.4. Стимуляция Т-клеток гибридными белками GST-ESAT-6 и GST-TB10.4 индуцируют продукцию преимущественно IFNγ, тогда как гибридный бело GST-HspX приводит к формированию преимущественно TNFa-продуцирующих Т-лимфоцитов.
4. При детекции антител в сыворотках крови больных активной и латентной формой туберкулеза было показано, что гибридные белки GST-HspX, GST-TB 10.4 и GST-ESAT-6 специфически взаимодействуют с антителами к M. tuberculosis
5. Полученные гибридные белки могут быть использованы в качестве специфических индукторов при проведении иммунологических исследований, а также для дальнейшего изучения протективных свойств данных белков на моделях экспериментального туберкулеза.
ИЛИ
Поиск аналога
📕 Список литературы
🖼 Скриншоты
🛒 Оформить заказ
⚡ Работу высылаем в течении 5 минут после оплаты.