Список условных обозначений и сокращений 4
Введение 5
1. Обзор литературы 7
1.1. Общий принцип организации CRISPR-Cas систем 7
1.2. Использование CRISPR-Cas систем в генной инженерии 14
1.3. Разнообразие Cas белков 2 класса – Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas13a 16
1.4. CasX – отдельное семейство редакторов генома 18
2. Материалы и методы 22
2.1.Праймеры 22
2.2. Среды и растворы, использованные в работе 23
2.3. Гель-электрофорез в агарозном геле и ПААГ 24
2.4. Молекулярное клонирование, методы работы с бактериями и плазмидами 25
2.5. Синтез рекомбинантного белка в клетках-продуцентах Escherichia coli штамма
Rosetta (DE3) и анализ его растворимости 27
2.6. Выделение и хроматографическая очистка рекомбинантного белка 28
2.7. Синтез направляющей РНК 30
2.8. Синтез ДНК-мишеней 30
2.9. Проведение эндонуклеазной реакции in vitro 31
3. Результаты 31
3.1. Конструирование плазмидного вектора для экспрессии системы pET21a CasX 31
3.2. Клонирование pET21a CasX 33
3.3. Синтез белка DpbCasX в клетках-продуцентах E. сoli штамма Rosetta (DE3) и
анализ его растворимости 34
3.4. Конструирование плазмидного вектора с последовательностью МВР и повторное
клонирование 35
3.5. Выделение рекомбинантного белка DpbCasX_MBP и его хроматографическая
очистка 37
3.6. Проведение эндонуклеазной реакции in vitro 41
4. Обсуждение 44
Выводы 473
Благодарности 48
Список использованной литературы
Изменение ДНК живых организмов представляет большой интерес для области биотехнологии и медицины. Целевое редактирование последовательности ДНК позволяет изучать функции генов, вносить изменения в геном путем удаления дефектных или же введения новых последовательностей. На сегодняшний день большая часть подходов для изменения генома основана на создании направленных «разрезов» в геномной ДНК, которые затем исправляются внутриклеточными системами репарации, что позволяет вставлять новые последовательности путем рекомбинации или нокаутировать гены, за счет негомологичного воссоединения образовавшихся после разрыва молекулы концов.
Для внесения изменений в конкретном сайте генома используют мегануклеазы, нуклеазы с доменом «цинковые пальцы» Zn-fingers nucleases (ZFN) и нуклеазоподобные активаторы транскрипции Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALEN), последовательности автосплайсируемых интронов [Guha, Wai, Hausner, 2017].
С 2014 года в качестве инструмента генного редактирования широкое применение получили CRISPR-Cas системы адаптивного иммунитета бактерий [Doudna, Charpentier, 2014]. Локус CRISPR и ассоциированные с ним гены Cas помогают бактериям запоминать, узнавать и уничтожать чужеродные генетические элементы. CRISPR – своеобразная копилка участков чужеродного генетического материала. Cas белок работает в комплексе с направляющей РНК, которая комплементарно связывается с ДНК мишенью. Благодаря этому эндонуклеаза узнает целевой сайт и может вносить по нему двунитевые разрывы в молекулу. Гибридные РНК можно синтезировать искусственно и вместе с эффекторным белком Cas направлять на разнообразные мишени.
Система проста и удобна в использовании, с ее помощью можно редактировать ДНК эукариотических организмов с высокой точностью до одного нуклеотида. Наиболее известная и хорошо изученная система – CRISPR/Cas9 бактерии Streptococcus pyogenes, и она уже активно используется в генной инженерии [Jinek и др., 2013; Tang и др., 2017; Yao и др., 2018]. Но SpCas9 обладает рядом недостатков: нуклеаза неспецифична и может вызывать нежелательные мутации, большой размер гена SpCas9 не позволяет осуществлять его эффективную доставку аденоассоциированными вирусами, выбор мишеней ограничен NGG-фланкированными сайтами. Поэтому характеристика неизученных Cas-белков из разных бактерий открывает возможности для нахождения новых, наиболее эффективных инструментов для геномного редактирования.6
Целью данной работы было продемонстрировать активность CasX нуклеазы из Deltaproteobacteria.
Для достижения этой цели был поставлен ряд задач:
1. Создать генетическую конструкцию для экспрессии системы pET21a CasX.
2. Получить рекомбинантный белок DpbCasX.
3. Показать в условиях in vitro нуклеазную активность белка DpbCasX
1. Создан вектор на основе плазмиды pET21a для экспрессии гена CasX_MBP в клетках E. coli штамма Rosetta (D3).
2. Получен рекомбинантный белок DpbCasX_MBP.
3. Анализ нуклеазной активности белка DpbCasX_MBP в условиях in vitro показал, что при инкубации с направляющей РНК эндонуклеаза расщепляет ДНК-мишень, содержащую РАМ.
4. DpbCasX_MBP эффективно расщепляет ДНК-мишень в диапазоне температур от 35 до 50°C.
