Введение 4
Глава 1. Обзор литературы 6
1.1. Адаптация Chlamydomonas к голоданию по фосфору: основные компоненты 6
1.1.1. Глобальный регулятор ₽SR1 6
1.1.2. PSR1-зависимая экспрессия генов в условиях голодания 8
1.1.3. Связь дефицита фосфора и фотосинтеза 10
1.1.4. Модель регуляции ответов при недостатке фосфора 11
1.2. Усеченные гемоглобины C. reinhardtii 13
Глава 2. Материалы и методы 16
2.1. Используемые штаммы и условия их культивирования 16
2.2. Анализ экспрессии генов 17
2.2.1. Выделение РНК 17
2.2.2. Синтез кДНК 18
2.2.3. ПЦР в режиме реального времени 19
2.3. Анализ генерации NO 21
2.3.1. Количественное измерение уровней NO 21
2.3.2. Измерение концентрации хлорофилла 22
2.3.3. Выделение белков и измерение их концентрации 22
Глава 3. Результаты 24
3.1. Транскрипция THB-генов в условиях голодания по фосфору 24
3.2. Экспрессия THB1 и THB2 в штаммах, мутантных по транскрипционному
регулятору PSR1 25
3.3. Роль окиси азота (NO) в контроле экспрессии THB1 и THB2 в условиях дефицита
фосфора 27
3.4. Генерация NO в клетках в условиях дефицита фосфора 29
Глава 4. Обсуждение результатов 31
Заключение 32
Выводы 33
Благодарности 34
Список литературы 35
В мировой литературе последних лет особенно интенсивно обсуждается проблема, связанная с исследованием молекулярных механизмов, определяющих у разных по уровню организации микроорганизмов восприятие и реализацию клеткой специфических ответов на действующие сигналы, включая такие, как изменения физико-химических параметров окружающей среды. В отличие от прокариот и некоторых гетеротрофных эукариотических микроорганизмов, молекулярные компоненты путей адаптации которых изучаются на протяжении длительного времени и поняты во многих деталях (Лось, 2010; Storz, Spiro, 2011; Horikoshi, 2010; Hohmann, 2002; Kuhn, Klipp, 2012), анализ механизмов регуляции стрессовых ответов фотосинтезирующих эукариотических микроорганизмов начат сравнительно недавно, и молекулярные механизмы описаны главным образом у модельного представителя - Chlamydomonas reinhardtii.
Одним из компонентов систем адаптации C. reinhardtii по последним данным являются усеченные гемоглобины, ТНВ. 12 генов, кодирующих представителей семейства были выявлены в геноме C. reinhardtii (Hemschemeier et al., 2013; Huwald et al., 2015). Было установлено, что ТНВ8 вовлечен в ответы микроорганизма на гипоксию (Hemschemeier et al., 2013), а ТНВ1 связан с контролем метаболизма азота (Johnson et al., 2014; Sanz-Luque et al., 2015). Кроме того, THB1 способен взаимодействовать с нитратредуктазой для детоксикации окиси азота и перевода ее в нитрат (Sanz-Luque et al., 2015; Chamizo-Ampudia et al., 2017). Показано, что три ТНВ, ТНВ1, ТНВ2 и ТНВ12, экспрессируются в условиях голодания по сере (Minaeva et al., 2017). Однако пока неясно, насколько функции ТНВ могут быть специфичными или глобальными (общими) в разных стрессовых условиях, прежде всего в условиях дефицита такого важного макроэлемента, как фосфор.
Поскольку предварительные данные свидетельствовали об увеличении транскрипции ТНВ1, цель работы состояла в выявлении усеченных гемоглобинов Chlamydomonas reinhardtii, индуцируемых в условиях голодания по фосфору и установлении ключевых сигнальных молекул и потенциальных регуляторов, контролирующих транскрипцию выбранных для анализа ТНВ в среде без фосфора.
Были сформулированы следующие задачи работы:
1. На основе сравнительного анализа экспрессии двенадцати генов,
кодирующих усеченные гемоглобины выявить ТНВ-ген(ы), индуцируемые в условиях голодания по фосфору и выбрать ген(ы) для последующего анализа механизмов их регуляции.
2. Установить, вовлечен ли глобальный регулятор адаптивного ответа C. reinhardtii к условиям дефицита фосфора PSR1 в транскрипционный контроль индуцируемых в условиях голодания по фосфору ТНВ-гена(ов), выбранных для анализа.
3. Проверить высказанную гипотезу о возможности генерации окиси азота в условиях дефицита фосфора и возможной роли NO в контроле транскрипции ТНВ-генов, индуцируемых в условиях голодания по фосфору.
В работе показано, что дефицит фосфора индуцирует транскрипцию семи THB- генов. Кроме того, впервые выявлено формирование окиси азота при удалении фосфора из среды.
Анализ регуляции транскрипции ТНВ-генов, кодирующих усеченные гемоглобины, Chlamydomonas reinhardtii в условиях дефицита фосфора, позволяет прийти к следующему заключению:
В условиях голодания клеток по фосфору происходит увеличение транскрипции семи генов, из которых уровни экспрессии трех (ТНВ1, ТНВ2 и ТНВ12) превышают 10-50 раз, а уровни еще четырех (ТНВ3, ТНВ4, ТНВ5 и ТНВ6) увеличиваются только в 2-3 раза.
Анализ штаммов, мутантных по гену PSR1 показал, что при удалении фосфора из среды транскрипция ТНВ1 не контролируется регулятором PSR1, тогда как экспрессия ТНВ2 находится под контролем этого транскрипционного фактора.
Впервые показано, что адаптация C. reinhardtii к дефициту фосфора в среде сопровождается генерацией окиси азота, которая вовлечена в контроль индукции ТНВ1 и ТНВ2.
По нашему мнению окись азота и усеченные гемоглобины ТНВ1 и ТНВ2 могут представлять общие компоненты ответов C. reinhardtii на дефицит в среде основных макроэлементов: азота, серы и фосфора.
