Введение 3
2. Обзор литературы 5
2.1 Механизм функционирования ГКГС 5
2.2 История открытия и изучения ГКГС 8
2.3 Молекулярно-генетические методы типирования 9
2.3.1 Генотипирование с помощью олигонуклеотидных зондов 10
2.3.2 Праймер-специфичное генотипирование 10
2.3.3 Генотипирование, основанное на секвенировании 11
2.4 Методы генотипирования in silico 11
2.4.1 Методы генотипирования по данным микрочипов 12
2.4.4.1 Athlates 13
2.4.2.2 HLA-LA 14
3. Материал и методы 15
3.1 Подготовка данных и генотипирование программой Athlates. 17
3.2 Подготовка данных и генотипирование программой HLA-LA 18
4. Результаты и обсуждение 19
4.1 Генотипирование с помощью программы Athlates 19
4.2 Генотипирование с помощью программы HLA-LA 20
4.3 Сравнение программ генотипирования по аллелям генов ГКГС 22
5. Заключение 24
Список литературы 25
Приложение 28
Главный комплекс гистосовместимости человека (ГКГС) или человеческие лейкоцитарные антигены - это комплекс трансмембранных белков, являющийся ключевым в распознавании чужеродных молекул и формировании иммунного ответа. Белки комплекса кодируются более чем 200 генами, которые располагаются на 6 хромосоме. Основная функция ГКГС - презентация антигенов на поверхности клеток для их последующего распознавания Т-лимфоцитами.
Существуют три класса молекул ГКГС. Молекулы ГКГС класса I отвечают за систему распознавания свой - чужой. При помощи молекул класса I на поверхность клеток выносятся аутоантигены, при заражении - вирусные антигены, антигены некоторых внутриклеточных бактерий и опухолевых клеток. Молекулы класса II отвечают за презентацию внеклеточных бактериальных антигенов, токсинов, аллергенов и т.д., и они присутствуют в основном у профессиональных антиген-презентирующих клеток (таких как дендритные клетки и В-лимфоциты). Гены ГКГС III класса кодируют некоторые элементы системы комплемента.
Так как белки ГКГС играю важную роль в иммунной системе, гены, кодирующие эти белки, характеризуются очень высоким полиморфизмом: количество обнаруженных аллелей отдельных генов превышает 10 тысяч. Кроме того, различные аллели входящих в него генов ассоциированы со многими заболеваниями - такими как, например, диабет 2 типа, гепатит В, различные виды рака. Генотипирование по аллелям генов ГКГС проводится для оценки возможности трансплантации органов, так как молекулы данного комплекса определяют гистосовместимость. По этим причинам задача генотипирования образцов по аллелям генов ГКГС является важным этапом диагностики заболеваний, трансплантации органов и поиска новых локусов, сцепленных с заболеваниями.
Из-за множественного аллелизма задача генотипирования аллелей генов ГКГС методами in silicoсильно осложняется, начиная с этапа секвенирования и выравнивания и заканчивая собственно генотипированием. Разработан ряд программ для in silico генотипирования человеческих образцов по аллелям генов ГКГС, но не существует оптимального протокола. Таким образом, для получения качественных результатов необходимо оптимизировать процесс обработки данных и, собственно, генотипирования. В данной работе были протестированы различные методики обработки данных и in silico генотипирования образцов полногеномного секвенирования по аллелям генов ГКГС, а также разработан оптимальный алгоритм и методика, позволяющие значительно улучшить качество генотипирования, проводимого в рамках различных исследований. В настоящее время эта методика применяется для генотипирования образцов проекта "Российские Геномы".
Целью работы является оптимизация методов in silicoгенотипирования образцов полногеномного секвенирования по аллелям генов ГКГС.
Задачи:
1. Подготовка данных полногеномного секвенирования для генотипирования комплекса генов гистосовместимости (выравнивание прочтений и последующее выделение участка 6 хромосомы с исследуемыми генами).
2. Проведение in silicoгенотипирования при помощи специализированных программ.
3. Сравнение работы различных программ типирования и выравнивания, выбор наиболее точного метода.
4. Анализ результатов генотипирования по аллелям генов ГКГС.
В результате данной работы была проведена оценка двух методов in silico генотипирования образцов по аллелям генов ГКГС, а именно сравнение результатов работы программ Athlates и HLA-LA с результатами молекулярного типирования. Также было проведено сравнение результатов генотипирования в зависимости от выбора программ для первичного и вторичного выравнивания прочтений на базу данных генов ГКГС. Из полученных результатов следует, что генотипирование главного комплекса гистосовместимости человека программными методами на основе данных полногеномного секвенирования является сложной проблемой и требует тщательного тестирования для получения достоверных результатов.
В ходе представленной работы:
1. Были выявлены совместимые и несовместимые (BWA на этапе 1 + Athlates, bowtie2 на этапе 3 + Athlates) комбинации программ.
2. По результатам генотипирования можно предположить, что использование различных программ для вторичного выравнивания не влияет на качество генотипирования
3. Найдено наиболее оптимальное и точное сочетание программ BWA для выравнивания результатов полногеномного секвенирования и HLA-LA для определения аллелей генов ГКГС. Это сочетание программ было выбрано по следующим причинам:
• самая высокая точность генотипирования среди всех проверяемых комбинаций методов;
• доступна информация о степени достоверности генотипов, вычисляемая HLA- LA, которая может использоваться для более или менее строгой фильтрации результатов;
• на вход программе подаются результаты полногеномного выравнивания, то есть нет необходимости в дополнительных этапах обработки данных;
• программа активно разрабатывается и усовершенствуется.
Эти программы будут использоваться для генотипирования образцов по ГКГС в текущих и планируемых проектах, таких как «Российские Геномы» и полноэкзомный анализ ассоциаций инфицирования вирусом гепатита В.
