Действие гидрофобных моноаминов на гетеромерные протон-активируемые ионные каналы ASIC1a/2a

Введение 4
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1. Зачем нужны сенсоры pH в нервной системе? 7
1.2. Гены, субъединичный состав и основные характеристики 8
1.3. Структура и топология 10
1.3.1. Доменная организация ASICs 10
1.3.2. Механизм активации канала 12
1.4. Локализация, участие в физиологических и паталогических процессах 13
1.4.1. ASICs в головном мозге 13
1.4.2. ASICs в периферической нервной системе 15
1.4.3. Физиологическая роль 15
1.4.4. ASICs в паталогических состояниях 19
1.5. Фармакология 20
1.5.1. Основные синтетические вещества 20
1.5.2. Токсины 22
1.5.3. Эндогенные вещества 23
1.5.4. Гидрофобные моноамины 24
Глава 2. Материалы и методы 28
Экспрессия гетеромерных протон-активируемых ионных каналов 28
Регистрация протон-вызванных трансмембранных токов 29
Используемые растворы 29
Обработка и представление данных 30
Глава 3. Результаты и обсуждение 32
3.1. Характеристика ответов ASIC1a/2a каналов 32
3.2. Подбор экспериментальных протоколов и их параметров 33
3.2.1. Протоколы для изучений действия амитриптилина 35
3.2.2. Протоколы для изучений действия ИЭМ-2044, мемантина, гистамина 36
3.3. Действие амитриптилина на гетеромерные ASIC1a/2a каналы 38
3.4. Сравнение действия амитриптилина на разные ASICs 40
3.5. Действие мемантина, ИЭМ-2044 и гистамина на гетеромерные ASIC1a/2a каналы 41
Обсуждение 43
Выводы 45
Список использованной литературы 46
Купить

Актуальность проблемы. Протон-активируемые ионные каналы - это семейство нейрональных потенциал-независимых каналов, в основном проницаемых для Na+. Они активируются в ответ на быстрое закисление внеклеточной среды, но, кроме того, некоторые из них чувствительны и к устойчивому ацидозу. Они экспрессируются как в центральной, так и в периферической нервной системе, где представлены гомо- или гетеротримерами. При этом биофизические и фармакологические характеристики канала сильно меняются в зависимости от его субъединичного состава. Наиболее характерными субъединицами для ПНС являются ASIC3 и ASIClb, и они практически не встречаются за её пределами. Для ЦНС основными являются субъединицы ASICla, ASIC2a и ASIC2b, но они встречаются и в других отделах нервной системы [Wemmie, Taugher, Kreple, 2013]. Большинство протон-вызванных токов в головном мозге опосредованы гомомерными ASIC1a и гетеромерными ASIC1a/2a каналами [Wu и др., 2016], а в некоторых областях мозга, например, в интернейронах гиппокампа, популяция гетеромеров ASIC1a/2a значительна [Weng, Lin, Lien, 2010].
Столь широкая распространённость этих каналов во всех отделах нервной системы млекопитающих сопряжена с их значительным вкладом в целый ряд как физиологических, так и паталогических состояний. Говоря о физиологической роли протон-активируемых ионных каналов, показана их вовлеченность в процессы синаптической пластичности, обучения и памяти [Wemmie и др., 2002], в процесс формирования страха [Coryell и др., 2007; Wemmie и др., 2003], и в несколько других процессов. При паталогических состояниях, сопровождающихся повышением кислотности внеклеточной среды (ишемия головного мозга, травмы, воспаление) роль ASICs также значительна [Li и др., 2010a; Sherwood и др., 2011]. Кроме того, свой вклад они вносят в патогенез таких нейродегенеративных заболеваний, как болезнь Паркинсона [Arias и др., 2008] и болезнь Хантингтона [Wong и др., 2008].
С момента первой регистрации протон-вызванных токов в нервной системе [Krishtal, Pidoplichko, 1980] прошло уже практически 40 лет, в то время как активное изучение протон-активируемых ионных каналов идёт лишь с 1997-ого года, когда они впервые были клонированы и выделены в отдельное семейство [Waldmann и др., 1997].
Основными инструментами, позволяющими изучать функции протон-активируемых каналов, являются нокаут генов, кодирующих отдельные субъединицы, а также селективные фармакологические агенты, избирательно влияющие на каналы различного субъединичного состава, объем которых на сегодняшний день достаточно ограничен. Поиск и изучение лигандов протон-активируемых каналов представляет интерес сразу по двум причинам: с одной стороны - исследования такого рода позволят изучать биофизические характеристики каналов и их физиологические функции, с другой, что не менее важно - позволят находить селективные агонисты и антагонисты, которые могут быть использованы в клинической практике в качестве точечных инструментов модуляции различных ASICs.
Цель и задачи работы. Большая часть предыдущих фармакологических работ проводилась на рекомбинантных гомомерных ASICs, а также на изолированных нейронах, экспрессирующих как гомомерные, так и гетеромерные варианты. Исследования на гомомерных каналах позволяют находить вещества, обладающие селективным действием, а также определять механизм их действия и сайты связывания с каналом. Изучение нативных ASICs в нейронах позволяют описывать влияние этих веществ в более физиологических, приближенных к реальным, условиях, а также делать предположения о возможном применении отдельных веществ медицинской практике.
Ранее в лаборатории биофизики синаптических процессов ИЭФБ РАН было охарактеризовано действие достаточно большого количества небольших амин-содержащих веществ, обладающих тем или иным действием в отношении гомомерных ASICla и ASIC2a каналов, некоторые из которых оказались активными и на нативных ASICs нейронов [Nagaeva и др., 2016a; Nagaeva и др., 2016b; Nikolaev и др., 2019; Tikhonova и др., 2015]. Тем не менее, действие нескольких веществ на нативных каналах не совпадало с таковым на гомомерных каналах, из чего было сделано предположение о том, что нейроны экспрессируют гетеромерные варианты. Соответственно, чтобы охарактеризовать действие веществ именно на гетеромеры, было принято решение использовать гетерологическую экспрессию ASIC1a/2a каналов в клеточной линии CHO, которая является более простой моделью, чем изолированные нейроны.
Таким образом, целью данной работы является оценка воздействия гидрофобных моноаминов, активных в отношении ASICla и ASIC2a гомомеров, на гетеромерные ASIC1a/2a каналы, экспрессируемые в клеточной линии CHO.
Опираясь на поставленную цель, были сформулированы следующие задачи:
1. Освоить методику экспрессии гетеромерных каналов в клетках СНО и регистрацию протон-вызванных трансмембранных токов с помощью метода пэтч-кламп (конфигурация «целая клетка», режим фиксации потенциала);
2. Определить основные функциональные параметры ответов гетеромерных каналов при их экспрессии в системе CHO, а именно характер активации и десенситизации;
3. Подобрать набор экспериментальных протоколов и адаптировать их параметры для работы с гетеромерами ASIC1a/2a;
4. С использованием этих протоколов изучить воздействие известных лигандов гомомерных каналов на параметры ответов гетеромеров ASIC1a/2a, а также сравнить действие этих соединений на разные ASICs.
Купить