Амилоиды представляют собой фибриллярные белковые агрегаты, которые формируются за счет образования упорядоченных межмолекулярных в-складчатых листов. Амилоидным агрегатам присуще несколько физико-химическим свойств, которые позволяют отличать их от остальных белковых агрегатов:
- связывание с амилоид-специфическими красителями, такими как Конго красный, а также Тиофлавин S и Тиофлавин T;
- высокий уровень устойчивости к воздействию ионных детергентов;
- способность протофибрилл к автокаталитическому росту за счет присоединения свободных мономеров;
Большинство известных амилоидов являются патогенными и связаны с целой группой заболеваний животных и человека, таких как болезнь Альцгеймера [Reitz et al., 2011], болезнь Хангтингтона [Lee et al., 2013], системный амилоидоз AA [Westermark and Westermark, 2009] и другие. Однако, наряду с патогенными, были выявлены и функциональные амилоиды, которые в норме присутствуют во многих живых организмах и выполняют жизненно важные функции. Наиболее известными среди них являются белки паутины Nephila edulis и шелка Bomhyx mori и некоторых других насекомых [Andersson et al, 2016] - спидроин и фиброин. Также выявлены функциональные
амилоиды бактерий, входящие в состав экстраклеточной биопленки (например, у Bacillus suhtillus амилоидный белок TasA [Romero, 2010]). У Saccharomyces cerevisiae выявлен функциональный белок Bgl2 [Gorkovskii, 2009], стабилизирующий клеточную стенку. У человека был обнаружен амилоидный белок Pmel17, который в норме связывает меланин [Fowler D.M., 2006].
В последние годы появляются данные, что амилоиды присутствуют в норме в ооцитах многих животных. Есть данные, что в оболочке яиц некоторых беспозвоночных, рыб, амфибий, птиц и млекопитающих есть белки, способные образовывать агрегаты, которые связываются с амилоид-специфичными красителями.
В нашей лаборатории был разработан метод протеомного скрининга амилоидов PSIA LC-MALDI, основанный на устойчивости амилоидных фибрилл к ионным детергентам [Nizhnikov et al., 2014]. Этот метод применим для работы с разными организмами и позволяет отделять белки, формирующие высокомолекулярные амилоидоподобные агрегаты, от прочих белков.
В данной работе проведён скрининг белков для выявления наиболее перспективных кандидатов на роль функциональных амилоидов в яичниках Drosophila melanogaster. Плодовая мушка дрозофила удобна в разведении в лабораторных условиях, всесторонне изучена, в том числе у нее хорошо исследован оогенез.
Таким образом, целью данной работы является выявление кандидатов на роль функциональных амилоидов в яичниках Drosophila melanogaster.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
1. Окрашивание срезов яичников Drosophila melanogaster амилоидспецифичными красителями Тиофлавин S и Конго красный.
2. Проведение протеомного скрининга для выявления белков-кандидатов на роль функциональных амилоидов в ооцитах Drosophila melanogaster.
3. Анализ агрегации наиболее перспективного белка-кандидата в дрожжах Saccharomyces cerevisiae.
Мы показали, что белок хориона ооцитов дрозофилы s36 связывает амилоидспецифичные красители Тиофлавин S и Конго красный, формирует SDS-устойчивые агрегаты в яичниках дрозофилы, содержит амилоидогенные последовательности, предсказанные биоинформатическими алгоритмами и химерный белок CP36-YFP при сверхпродукции формирует агрегаты в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Полученные результаты демонстрируют, что исследуемый белок обладает свойствами, характерными для амилоидов. Учитывая это, а также литературные данные о роли белка s36 в формировании хориона, в том числе микропиле, мы можем рассматривать этот белок в качестве кандидата на роль функционального амилоида в ооцитах Drosophila melanogaster.
