📄Работа №129284
Тема: Поиск функциональных амилоидов в ооцитах Drosophila melanogaster
Тип работы
Бакалаврская работа
Предмет
биология
Объем:
43 листов
Год:
2019
Просмотров:
54
4700
руб.
🛒 Купить работу
Не подходит эта работа?
Закажите новую по вашим требованиям
Узнать цену на написание
Закажите новую по вашим требованиям
Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
📋 Содержание
ВВЕДЕНИЕ 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Амилоиды 7
1.2. Разнообразие амилоидов 8
1.2.1. Патологические амилоиды 8
1.2.2. Функциональные амилоиды 10
1.2.3. Функциональные амилоиды в половом размножении 11
1.3. Метод протеомного скрининга амилоидов PSIA LC-MALDI 14
1.4. Оогенез Drosophila melanogaster 15
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 20
2.1. Линии мух Drosophila melanogaster 20
2.2. Штаммы микроорганизмов, среды и условия культивирования 20
2.3. Плазмиды 20
2.4. Методы подготовки и окраски криосрезов 21
2.4.1. Изготовление криосрезов 21
2.4.2. Окрашивание криосрезов амилоид-специфичным красителем Тиофлавин S 21
2.4.3. Окрашивание криосрезов амилоид-специфичным красителем Конго красный ..22
2.5. Флуоресцентная и поляризующая микроскопия криосрезов 22
2.6. Молекулярно-биологические методы 22
2.6.1. Протеомный скрининг амилоидов (PSIA LC-MALDI) 22
2.6.2. Выделение тотальной РНК из гомогенизированной ткани яичников Drosophila
melanogaster 24
2.6.3. Стандартные генно-инженерные методы 24
2.7. Флуоресцентный анализ агрегации белков 26
2.8. Биоинформатический анализ аминокислотной последовательности 26
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 27
3.1. Связывание белка s36 с амилоид-специфичными красителями Тиофлавин S и Конго
красный 27
3.2. Проведение протеомных скринингов (PSIA LC-MALDI) яичников Drosophila
melanogaster 28
3.3. Биоинформатический анализ амилоидных свойств белка s36 30
3.4. Анализ агрегации химерного белка CP36-YFP 31
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 35
5. ВЫВОДЫ 36
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 37
БЛАГОДАРНОСТИ 43
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Амилоиды 7
1.2. Разнообразие амилоидов 8
1.2.1. Патологические амилоиды 8
1.2.2. Функциональные амилоиды 10
1.2.3. Функциональные амилоиды в половом размножении 11
1.3. Метод протеомного скрининга амилоидов PSIA LC-MALDI 14
1.4. Оогенез Drosophila melanogaster 15
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 20
2.1. Линии мух Drosophila melanogaster 20
2.2. Штаммы микроорганизмов, среды и условия культивирования 20
2.3. Плазмиды 20
2.4. Методы подготовки и окраски криосрезов 21
2.4.1. Изготовление криосрезов 21
2.4.2. Окрашивание криосрезов амилоид-специфичным красителем Тиофлавин S 21
2.4.3. Окрашивание криосрезов амилоид-специфичным красителем Конго красный ..22
2.5. Флуоресцентная и поляризующая микроскопия криосрезов 22
2.6. Молекулярно-биологические методы 22
2.6.1. Протеомный скрининг амилоидов (PSIA LC-MALDI) 22
2.6.2. Выделение тотальной РНК из гомогенизированной ткани яичников Drosophila
melanogaster 24
2.6.3. Стандартные генно-инженерные методы 24
2.7. Флуоресцентный анализ агрегации белков 26
2.8. Биоинформатический анализ аминокислотной последовательности 26
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 27
3.1. Связывание белка s36 с амилоид-специфичными красителями Тиофлавин S и Конго
красный 27
3.2. Проведение протеомных скринингов (PSIA LC-MALDI) яичников Drosophila
melanogaster 28
3.3. Биоинформатический анализ амилоидных свойств белка s36 30
3.4. Анализ агрегации химерного белка CP36-YFP 31
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 35
5. ВЫВОДЫ 36
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 37
БЛАГОДАРНОСТИ 43
📖 Введение
Амилоиды представляют собой фибриллярные белковые агрегаты, которые формируются за счет образования упорядоченных межмолекулярных в-складчатых листов. Амилоидным агрегатам присуще несколько физико-химическим свойств, которые позволяют отличать их от остальных белковых агрегатов:
- связывание с амилоид-специфическими красителями, такими как Конго красный, а также Тиофлавин S и Тиофлавин T;
- высокий уровень устойчивости к воздействию ионных детергентов;
- способность протофибрилл к автокаталитическому росту за счет присоединения свободных мономеров;
Большинство известных амилоидов являются патогенными и связаны с целой группой заболеваний животных и человека, таких как болезнь Альцгеймера [Reitz et al., 2011], болезнь Хангтингтона [Lee et al., 2013], системный амилоидоз AA [Westermark and Westermark, 2009] и другие. Однако, наряду с патогенными, были выявлены и функциональные амилоиды, которые в норме присутствуют во многих живых организмах и выполняют жизненно важные функции. Наиболее известными среди них являются белки паутины Nephila edulis и шелка Bomhyx mori и некоторых других насекомых [Andersson et al, 2016] - спидроин и фиброин. Также выявлены функциональные
амилоиды бактерий, входящие в состав экстраклеточной биопленки (например, у Bacillus suhtillus амилоидный белок TasA [Romero, 2010]). У Saccharomyces cerevisiae выявлен функциональный белок Bgl2 [Gorkovskii, 2009], стабилизирующий клеточную стенку. У человека был обнаружен амилоидный белок Pmel17, который в норме связывает меланин [Fowler D.M., 2006].
В последние годы появляются данные, что амилоиды присутствуют в норме в ооцитах многих животных. Есть данные, что в оболочке яиц некоторых беспозвоночных, рыб, амфибий, птиц и млекопитающих есть белки, способные образовывать агрегаты, которые связываются с амилоид-специфичными красителями.
В нашей лаборатории был разработан метод протеомного скрининга амилоидов PSIA LC-MALDI, основанный на устойчивости амилоидных фибрилл к ионным детергентам [Nizhnikov et al., 2014]. Этот метод применим для работы с разными организмами и позволяет отделять белки, формирующие высокомолекулярные амилоидоподобные агрегаты, от прочих белков.
В данной работе проведён скрининг белков для выявления наиболее перспективных кандидатов на роль функциональных амилоидов в яичниках Drosophila melanogaster. Плодовая мушка дрозофила удобна в разведении в лабораторных условиях, всесторонне изучена, в том числе у нее хорошо исследован оогенез.
Таким образом, целью данной работы является выявление кандидатов на роль функциональных амилоидов в яичниках Drosophila melanogaster.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
1. Окрашивание срезов яичников Drosophila melanogaster амилоидспецифичными красителями Тиофлавин S и Конго красный.
2. Проведение протеомного скрининга для выявления белков-кандидатов на роль функциональных амилоидов в ооцитах Drosophila melanogaster.
3. Анализ агрегации наиболее перспективного белка-кандидата в дрожжах Saccharomyces cerevisiae.
- связывание с амилоид-специфическими красителями, такими как Конго красный, а также Тиофлавин S и Тиофлавин T;
- высокий уровень устойчивости к воздействию ионных детергентов;
- способность протофибрилл к автокаталитическому росту за счет присоединения свободных мономеров;
Большинство известных амилоидов являются патогенными и связаны с целой группой заболеваний животных и человека, таких как болезнь Альцгеймера [Reitz et al., 2011], болезнь Хангтингтона [Lee et al., 2013], системный амилоидоз AA [Westermark and Westermark, 2009] и другие. Однако, наряду с патогенными, были выявлены и функциональные амилоиды, которые в норме присутствуют во многих живых организмах и выполняют жизненно важные функции. Наиболее известными среди них являются белки паутины Nephila edulis и шелка Bomhyx mori и некоторых других насекомых [Andersson et al, 2016] - спидроин и фиброин. Также выявлены функциональные
амилоиды бактерий, входящие в состав экстраклеточной биопленки (например, у Bacillus suhtillus амилоидный белок TasA [Romero, 2010]). У Saccharomyces cerevisiae выявлен функциональный белок Bgl2 [Gorkovskii, 2009], стабилизирующий клеточную стенку. У человека был обнаружен амилоидный белок Pmel17, который в норме связывает меланин [Fowler D.M., 2006].
В последние годы появляются данные, что амилоиды присутствуют в норме в ооцитах многих животных. Есть данные, что в оболочке яиц некоторых беспозвоночных, рыб, амфибий, птиц и млекопитающих есть белки, способные образовывать агрегаты, которые связываются с амилоид-специфичными красителями.
В нашей лаборатории был разработан метод протеомного скрининга амилоидов PSIA LC-MALDI, основанный на устойчивости амилоидных фибрилл к ионным детергентам [Nizhnikov et al., 2014]. Этот метод применим для работы с разными организмами и позволяет отделять белки, формирующие высокомолекулярные амилоидоподобные агрегаты, от прочих белков.
В данной работе проведён скрининг белков для выявления наиболее перспективных кандидатов на роль функциональных амилоидов в яичниках Drosophila melanogaster. Плодовая мушка дрозофила удобна в разведении в лабораторных условиях, всесторонне изучена, в том числе у нее хорошо исследован оогенез.
Таким образом, целью данной работы является выявление кандидатов на роль функциональных амилоидов в яичниках Drosophila melanogaster.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
1. Окрашивание срезов яичников Drosophila melanogaster амилоидспецифичными красителями Тиофлавин S и Конго красный.
2. Проведение протеомного скрининга для выявления белков-кандидатов на роль функциональных амилоидов в ооцитах Drosophila melanogaster.
3. Анализ агрегации наиболее перспективного белка-кандидата в дрожжах Saccharomyces cerevisiae.
✅ Заключение
Мы показали, что белок хориона ооцитов дрозофилы s36 связывает амилоидспецифичные красители Тиофлавин S и Конго красный, формирует SDS-устойчивые агрегаты в яичниках дрозофилы, содержит амилоидогенные последовательности, предсказанные биоинформатическими алгоритмами и химерный белок CP36-YFP при сверхпродукции формирует агрегаты в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Полученные результаты демонстрируют, что исследуемый белок обладает свойствами, характерными для амилоидов. Учитывая это, а также литературные данные о роли белка s36 в формировании хориона, в том числе микропиле, мы можем рассматривать этот белок в качестве кандидата на роль функционального амилоида в ооцитах Drosophila melanogaster.
ИЛИ
Поиск аналога
📕 Список литературы
🖼 Скриншоты
🛒 Оформить заказ
⚡ Работу высылаем в течении 5 минут после оплаты.