ВВЕДЕНИЕ 4
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Биология фототрофных пурпурных бактерий 7
1.2 Биология и генетикаRhodobacter sphaeroides 13
1.3 Биология и генетикаRhodopseudomonas palustris 15
1.4 Биосинтез цитокининов у прокариотических микроорганизмов 18
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 22
2.1 Штаммы микроорганизмов 22
2.2 Питательные среды и условия выращивания 22
2.3 Молекулярно-генетические методы 23
2.3.1 Выделение плазмидной ДНК 23
2.3.2 Выделение геномной ДНК 23
2.3.3 Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ) 24
2.3.4 Электрофорез в агарозном геле 24
2.3.5 Рестрикция ДНК 24
2.3.6 Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 25
2.3.7 Выделение РНК с помощью реагентаТризол 25
2.3.8 Обратная транскрипция 25
2.3.9 Лигирование фрагментов ДНК в плазмиды 26
2.3.10 Трансформация клеток E.coli 26
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 27
3.1 Освоение методов работы с ФНПБ: подбор сред и оптимальных условий для
культивирования этих бактерий 27
3.2 Поиск последовательности гена ipt в выделенных образцах ДНК методом
ПЦР и ПЦР-РВ 27
3.3 Анализ экспрессии гена ipt в различных условиях выращивания культур
бактерий 30
3.4 Определение генетического контекста гена ipt в геномах исследуемых
штаммов ФНПБ 33
ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ 34
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 35
В 1955 г. Скугом и Миллером в Висконсинском университете был открыт новый тип фитогормонов. Активное вещество выделили в кристаллическом виде и установили, что оно является 6-фурфуриламинопурином, который образуется из дезоксиаденозина при деградации ДНК. Поскольку его добавление к питательной среде, содержащей сахарозу, элементы минерального питания, витамины и ауксин, вызывало переход клеток изолированной сердцевины стебля табака к делению, это вещество получило название кинетин (от слова кинез — деление). Вскоре оно было синтезировано. Последовал синтез большого числа его химических аналогов, обладающих такой же или даже более высокой биологической активностью. Все эти вещества были объединены под общим названием цитокинины [Романов, 2009].
По химической структуре цитокинины являются Ж-изопренилированными производными адениннуклеотидов (рис. 1). Ключевой фермент в биосинтезе цитокининов - изопентенилтрансфераза (IPT; EC 2.5.1.27), присоединяет изопентенильный остаток к АМФ у бактерий, и к АДФ или АТФ у растений [Kakimoto, 2006, Sakakibara, 2001]. Другой тип изопентенилтрансфераз - tRNA-IPTs (EC 2.5.1.8) катализирует присоединение изопентенильной группы к аденозину (i6A) в положении 37 (А37) около 3’-конца петли антикодона у некоторых видов тРНК (рис. 2). Эти тРНК- изопентенилтрансферазы обнаружены практически во всех организмах от простейших до животных [Kamada- Nobusada, 2009]. Наиболее полно функции цитокининов проявляются в растениях и механизмы их действия хорошо изучены. Однако цитокинины широко распространены не только в растительном мире, но также и у микроорганизмов, в основном симбиотических или паразитических. Среди микроорганизмов, способных к биосинтезу цитокининов, наиболее известна почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens, вирулентные штаммы которой, взаимодействуя с раневой поверхностью растения, индуцируют у него опухолеобразование. Агентом, вызывающим неконтролируемое деление клеток в растении, является T-ДНК (transfer DNA) - фрагмент агробактериальной Ti-плазмиды (tumor inducing) с геном биосинтеза цитокининов ipt, который интегрируется в геном растений. Т-ДНК в клетке растения-хозяина запускает неконтролируемый синтез гормонов (ауксинов и цитокининов) и дальнейшее образование азотсодержащих веществ - опинов, которые служат источником питания для агробактерий [Лутова, 1998, Krall, 2002].
Цитокинины - биологически активные вещества, которые очень широко распространены во всех царствах. Среди прокариотических микроорганизмов наличие цитокининов показано в основном для фитопатогенных бактерий, в которых их основная функция заключается в стимуляции избыточного синтеза фитогормонов у растения- хозяина. Фототрофные несерные пурпурные бактерии филогенетически близки с агро- и другими фитопатогенными бактериями, однако до недавнего времени у них не было показано наличие генов биосинтеза цитокининов. Предметом данного исследования стали штаммы ФНПБ Rba. sphaeroides 2.4.1, Rba. sphaeroides 2R и Rps. palustris. Были установлены оптимальные условия и подобрана среда для выращивания исследуемых культур ФНПБ. Методами рестрикционного анализа и ПЦР-амплификации удалось подтвердить наличие в геномах исследуемых штаммов фрагмента гена ipt длиной 364 п.н. Был проведен анализ экспрессии этого гена в различных условиях выращивания исследуемых штаммов ФНПБ: в миксотрофных условиях, в темноте, на свету в присутствии кислорода и на свету аноксигенно.
По результатам проведенной работы можно сформулировать следующие выводы:
1. Исследуемые штаммы Rba. sphaeroides 2.4.1, Rba. sphaeroides 2R и Rps. palustris оптимально растут на трис-ацетатной среде ТАР с добавлением аргинина в качестве источника азота при температуре 24-25оС в миксотрофных условиях.
2. Ген биосинтеза цитокининов ipt экспрессируется во всех исследуемых штаммах ФНПБ.
3. Для штамма Rba. sphaeroides 2.4.1. оптимальным условием для экспрессии гена ipt является выращивание его в темноте. Штамм Rps. palustris в присутствии кислорода и в темноте, и на свету экспрессирует ген ipt примерно на одном уровне. Для обоих штаммов показано, что ген ipt подвержен световой регуляции.
