ВВЕДЕНИЕ 3
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 5
Гематоэнцефалический барьер 5
Циркумвентрикулярные органы 6
Area postrema 7
Межклеточные контакты 8
Свойства белков клаудинов и окклюдина 10
5.1. Свойства клаудинов-3,-5 10
5.2. Свойства клаудинов-4,-8,-10,-12 11
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 12
3.1. Экспериментальные животные. 12
3.2. Методика получения замороженных срезов. 12
3.3. Иммуногистохимический анализ 12
3.4.. Конфокальная микроскопия. 13
ПРИЛОЖЕНИЕ 14
Таблица 1. Используемые первичные антитела 14
Таблица 2. Используемые вторичные антитела 15
Таблица 3. Используемые другие красители 15
РЕЗУЛЬТАТЫ 16
4.1 Иммуногистохимическое определение белков-маркеров различных типов клеток в
головном мозге крысы. 16
4.2 Иммуногистохимическое определение окклюдина в лобных долях 17
4.3 Иммуногистохимическое определение клаудинов-4,-8,-10,-12 в лобных долях 18
4.4 Иммуногистохимическое определение белков плотных контактов в area postrema 19
ОБСУЖДЕНИЕ 19
ВЫВОДЫ 20
БЛАГОДАРНОСТИ 20
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 21
Системные функции мозга базируются на гистологической, биохимической, медиаторной и функциональной гетерогенности свойств различных областей мозга. В частности, тканевые барьеры, являющиеся необходимыми структурами мозга и обеспечивающие разделение отдельных компартментов мозга, существенно различаются по своим свойствам. Гематоэнцефалический барьер, разделяющий плазму крови кровеносных сосудов и тканевую жидкость головного мозга, обладает выраженными барьерными свойствами. Строго регулируемый трансклеточный и селективный межклеточный транспорт обеспечивают сохранение параметров внутренней среды мозга и, тем самым, создают оптимальные условия для функций нейронов и мозга в целом [1]. В тоже время существуют области мозга, объединенные понятием циркумвентрикулярные органы, в которых барьерные свойства гематоэнцефалического барьера изменены. Предполагается, что некоторые из них представляют из себя структуры, в которых происходит интеграция метаболических сигналов плазмы крови и деятельности нервных клеток. Так, одна из областей продолговатого мозга, а именно area postrema,представляет из себя образование, в котором в результате повышенной проницаемости гематоэнцефалического барьера метаболиты крови могут оказывать влияние на деятельность рядом расположенных нервных ядер, в частности моторного ядра блуждающего нерва [2].
Гематоэнцефалический барьер можно определить как совокупность тесно взаимодействующих между собой тканевых структур и физиологических механизмов, контролирующих обмен веществами между кровью и центральной нервной системой с целью поддержания условий, оптимальных для функционирования мозга. По существующим представлениям в гематоэнцефалический барьер входят следующие структуры: отростки астроцитов, перициты, эндотелий сосудов головного мозга, соединенный плотными контактами, а также базальная мембрана. Главную роль в обеспечении барьерной функции гематоэнцефалического барьера в настоящее время приписывается именно клеткам эндотелия сосудов головного мозга и соединяющим их плотным контактам [3]. Таким образом, изучение проницаемости эндотелия мозговых капилляров и механизмов его регуляции представляет собой первоочередную задачу при исследовании барьерных свойств этого тканевого барьера.
Основными белками, формирующими плотные контакты, являются: окклюдин [4], семейство клаудинов [5], белки адгезии JAM [6], трансмембранный белок трицеллюлин [7], а также цитоплазматические белки ZO (zonula occludens)-1, ZO-2, ZO-3 и цингулин, связывающие трансмембранные белки с актиновым цитоскелетом [8]. Свойства плотных контактов и их проницаемость определяются экспрессией трансмембранных белков семейства клаудина [5], насчитывающего в настоящий момент более 20 представителей. Кластеры различных клаудинов обеспечивают изменение селективной проницаемости эпителиального барьера от высокопроницаемого до непроницаемого состояния [9]. Поэтому изучение молекулярного разнообразия белков плотных контактов, в частности клаудинов, является актуальной задачей в изучении барьерных свойств тканевых барьеров мозга.
Ключевыми белками, участвующим в формировании плотных контактов между клетками эндотелия сосудов мозга, является клаудин-3 и -5. Функциональная роль клаудина-5 в формировании барьерных свойств эпителия сосудов мозга была показана в опытах с мышами, нокаутными по его гену. У этих животных гематоэнцефалический барьер стал проницаем для молекул с массой менее 800 Да [10]. Временное выключение гена клаудина-5 ведет к сходным изменениям в барьерных свойствах эндотелия сосудов и изменению поведения при тестовом введении тиролиберина. Восстановление экспрессии клаудина-5 снимает наблюдаемые изменения в проницаемости и поведении [11]. Однако, в обогащенной фракции эндотелия сосудов мозга обнаружены мРНК пятнадцати клаудинов, при этом ее содержание для разных клаудинов отличается на несколько порядков [12]. Кроме клаудина-3 и -5 высокий уровень транскриптов обнаружен для клаудина-4, -8, -10 и -12. В настоящий момент отсутствуют данные о наличии этих белков в ткани головного мозга, в частности в эндотелии сосудов.
Цель данного исследования состояла в иммуногистохимическом определении наличия и локализации клаудина-4, -8, -10 и -12 в различных по своим свойствам областях: ткани лобных долей и areapostremaмозга крысы.
В соответствии с целью было поставлено несколько задач:
1. Освоение различных методов для достижения результата: замороженных срезов, иммуногистохимического анализа, конфокальной микроскопии;
2. Идентификация различных типов клеток с помощью соответствующих белков-маркеров для верификации используемого метода иммуногистохимического исследования;
3. Изучение распределения белков плотных контактов клаудинов-4,-8,-10,-12 в лобных долях и area postrema
1. Методом иммуногистохимического анализа впервые показано наличие клаудина-4 в эндотелии сосудов лобных долей головного мозга крыс.
2. Сигнал от клаудина -8, -10, -12 в ткани лобных долей не идентифицирован.
3. Клаудин -4, -8, -10, -12 в области area postrema не были обнаружены.
