📄Работа №128319
Тема: Анализ агрегации фрагментов белка VTG2 Gallus domesticusв дрожжевой модельной системе
Тип работы
Дипломные работы, ВКР
Предмет
биология
Объем:
50 листов
Год:
2021
Просмотров:
60
4310
руб.
🛒 Купить работу
Не подходит эта работа?
Закажите новую по вашим требованиям
Узнать цену на написание
Закажите новую по вашим требованиям
Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
📋 Содержание
Список использованных сокращений 4
Введение 5
1. Обзор литературы 7
1.1. Амилоиды 7
1.1.1. Структурные особенности амилоидных фибрилл 7
1.1.2. Универсальные физико-химические свойства амилоидных фибрилл 9
1.2. Разнообразие амилоидов 10
1.2.1. Патологические амилоиды 10
1.2.2. Функциональные амилоиды 11
1.2.3. Функциональные амилоиды половых клеток 13
1.3. Вителлогенез у птиц 15
1.3.1. Стадии вителлогенеза 15
1.3.2. Состав яичного желтка птиц 18
1.4. Вителлогенин-2 - главный предшественник запасных белков яичного
желтка у птиц 19
2. Материалы и методы 22
2.1. Штаммы микроорганизмов, среды и условия культивирования 22
2.2. Генетические методы 22
2.3. Получение фрагментов гена VTG2 Gallus domesticus 24
2.4. Конструирование плазмид 25
2.5. Выделение белкового лизата из дрожжевых клеток 27
2.6. Фракционирование дрожжевого клеточного лизата 27
2.7. Белковый гель-электрофорез и Вестерн-блоттинг 28
2.8. Флуоресцентная микроскопия 28
3. Результаты и обсуждение 30
3.1. Биоинформатический поиск потенциально амилоидогенных
последовательностей VTG2 и получение плазмид для анализа агрегации фрагментов VTG2 в клетках S. cerevisiae 30
3.2. Анализ агрегации фрагментов белка VTG2 в клетках S. cerevisiaeс
помощью флуоресцентной микроскопии 35
3.3. Биохимический анализ агрегации фрагментов белка VTG2 в дрожжевых
клетках и анализ устойчивости агрегатов к SDS 37
4. Выводы 40
Список литературы 41
Благодарности
Введение 5
1. Обзор литературы 7
1.1. Амилоиды 7
1.1.1. Структурные особенности амилоидных фибрилл 7
1.1.2. Универсальные физико-химические свойства амилоидных фибрилл 9
1.2. Разнообразие амилоидов 10
1.2.1. Патологические амилоиды 10
1.2.2. Функциональные амилоиды 11
1.2.3. Функциональные амилоиды половых клеток 13
1.3. Вителлогенез у птиц 15
1.3.1. Стадии вителлогенеза 15
1.3.2. Состав яичного желтка птиц 18
1.4. Вителлогенин-2 - главный предшественник запасных белков яичного
желтка у птиц 19
2. Материалы и методы 22
2.1. Штаммы микроорганизмов, среды и условия культивирования 22
2.2. Генетические методы 22
2.3. Получение фрагментов гена VTG2 Gallus domesticus 24
2.4. Конструирование плазмид 25
2.5. Выделение белкового лизата из дрожжевых клеток 27
2.6. Фракционирование дрожжевого клеточного лизата 27
2.7. Белковый гель-электрофорез и Вестерн-блоттинг 28
2.8. Флуоресцентная микроскопия 28
3. Результаты и обсуждение 30
3.1. Биоинформатический поиск потенциально амилоидогенных
последовательностей VTG2 и получение плазмид для анализа агрегации фрагментов VTG2 в клетках S. cerevisiae 30
3.2. Анализ агрегации фрагментов белка VTG2 в клетках S. cerevisiaeс
помощью флуоресцентной микроскопии 35
3.3. Биохимический анализ агрегации фрагментов белка VTG2 в дрожжевых
клетках и анализ устойчивости агрегатов к SDS 37
4. Выводы 40
Список литературы 41
Благодарности
📖 Введение
Амилоиды представляют собой белковые фибриллярные агрегаты, имеющие упорядоченную межмолекулярную кросс-бета структуру. Амилоиды ассоциированы с большим количеством социально значимых амилоидозов и потому являются предметом многих клинических и фундаментальных исследований. К числу амилоидозов принадлежат нейродегенеративные болезни Альцгеймера, Паркинсона, Хангтингтона, латеральный амиотрофический склероз, прионные заболевания. Вместе с тем ежегодно появляются сведения о функциональных амилоидах, выполняющих жизненно важную роль в организме живых существ самых разных таксонов. Так, белок Curli принимает участие в образовании биопленок бактерий; гидрофобины грибов участвуют в адгезии и формировании спор (Bleem &Daggett, 2017); белок Pmel17 необходим для биогенеза и запасания меланина (Fowler et al., 2006). Помимо амилоидов выделяют амилоидоподобные белки, которые способны формировать белковые агрегаты, проявляющие некоторые из физико-химических характеристик амилоидов in vivoи in vitro.
Поиск публикаций в базе данных Pubmed по термину «amyloid» выдает две статьи за период с 1921 по 1930 гг. и около 25 тыс. за период с 2001 по 2010 гг. (Kisilevsky et al., 2016). В 2020 году число публикаций составило 7 501. Непрекращающийся лавинообразный рост числа работ, посвященных амилоидам, свидетельствует о всё возрастающем интересе к этой области исследований. По всей вероятности, на сегодняшний день охарактеризована лишь небольшая часть паталогических и функциональных амилоидов.
Ранее в нашей лаборатории были получены данные, которые позволяют выдвинуть гипотезу о существовании амилоидов в ооцитах курицы Gallus domesticus.Так, было показано, что амилоид-специфичный краситель Тиофлавин S окрашивает ооциты, а также клетки фолликулярного эпителия на ранней стадии развития ооцитов.
Результаты окрашивания криосрезов яичников домашней курицы дали основание для проведения протеомного скрининга амилоидоподобных белков из ооцитов курицы. Этот разработанный в нашей лаборатории метод позволяет выявить во всех тканях любых организмов белки, которые формируют патологические и функциональные амилоидоподобные агрегаты. Метод основан на таком свойстве амилоидных фибрилл как устойчивость к ионному детергенту додецилсульфату натрия (SDS) (Ryzhova et al., 2018). В протеомном скрининге белков, формирующих SDS-устойчивые агрегаты в ооцитах курицы, был выявлен белок Vitellogenin-2 (VTG2), выполняющий функцию главного предшественника запасных белков яичного желтка, что послужило предпосылкой для проведения дальнейших исследований.
В данной работе мы сфокусировали внимание на выявлении фрагментов белка VTG2, способных формировать детергент-устойчивые агрегаты. Для этих целей наилучшим образом подходит дрожжевая модельная система, в которой можно анализировать агрегацию гетерологичных белков, слитых с последовательностью флуоресцирующего белка, с помощью как цитологических, так и биохимических методов.
Таким образом, целью работы является анализ агрегации фрагментов белка VTG2 Gallus domesticusв дрожжевой модельной системе. Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Сконструировать плазмиды, которые продуцируют в дрожжевых клетках химерные белки, содержащие фрагменты VTG2, слитые с репортерной последовательностью флуоресцирующего белка YFP.
2. С помощью флуоресцентной микроскопии оценить способность исследуемых химерных белков формировать агрегаты в клетках дрожжей S. cerevisiae.
3. Провести анализ агрегации химерных белков, содержащих различные фрагменты VTG2, с помощью метода фракционирования дрожжевых клеточных лизатов.
4. Провести анализ устойчивости агрегирующих фрагментов VTG2 к обработке 1% SDS.
Поиск публикаций в базе данных Pubmed по термину «amyloid» выдает две статьи за период с 1921 по 1930 гг. и около 25 тыс. за период с 2001 по 2010 гг. (Kisilevsky et al., 2016). В 2020 году число публикаций составило 7 501. Непрекращающийся лавинообразный рост числа работ, посвященных амилоидам, свидетельствует о всё возрастающем интересе к этой области исследований. По всей вероятности, на сегодняшний день охарактеризована лишь небольшая часть паталогических и функциональных амилоидов.
Ранее в нашей лаборатории были получены данные, которые позволяют выдвинуть гипотезу о существовании амилоидов в ооцитах курицы Gallus domesticus.Так, было показано, что амилоид-специфичный краситель Тиофлавин S окрашивает ооциты, а также клетки фолликулярного эпителия на ранней стадии развития ооцитов.
Результаты окрашивания криосрезов яичников домашней курицы дали основание для проведения протеомного скрининга амилоидоподобных белков из ооцитов курицы. Этот разработанный в нашей лаборатории метод позволяет выявить во всех тканях любых организмов белки, которые формируют патологические и функциональные амилоидоподобные агрегаты. Метод основан на таком свойстве амилоидных фибрилл как устойчивость к ионному детергенту додецилсульфату натрия (SDS) (Ryzhova et al., 2018). В протеомном скрининге белков, формирующих SDS-устойчивые агрегаты в ооцитах курицы, был выявлен белок Vitellogenin-2 (VTG2), выполняющий функцию главного предшественника запасных белков яичного желтка, что послужило предпосылкой для проведения дальнейших исследований.
В данной работе мы сфокусировали внимание на выявлении фрагментов белка VTG2, способных формировать детергент-устойчивые агрегаты. Для этих целей наилучшим образом подходит дрожжевая модельная система, в которой можно анализировать агрегацию гетерологичных белков, слитых с последовательностью флуоресцирующего белка, с помощью как цитологических, так и биохимических методов.
Таким образом, целью работы является анализ агрегации фрагментов белка VTG2 Gallus domesticusв дрожжевой модельной системе. Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Сконструировать плазмиды, которые продуцируют в дрожжевых клетках химерные белки, содержащие фрагменты VTG2, слитые с репортерной последовательностью флуоресцирующего белка YFP.
2. С помощью флуоресцентной микроскопии оценить способность исследуемых химерных белков формировать агрегаты в клетках дрожжей S. cerevisiae.
3. Провести анализ агрегации химерных белков, содержащих различные фрагменты VTG2, с помощью метода фракционирования дрожжевых клеточных лизатов.
4. Провести анализ устойчивости агрегирующих фрагментов VTG2 к обработке 1% SDS.
✅ Заключение
1. Белок VTG2 содержит потенциально амилоидогенные последовательности.
2. Фрагменты белка VTG2 с 140-й по 497-ю аминокислоту, с 696-й по 1019-ю аминокислоту и с 1456-й по 1517-ю аминокислоту, слитые с YFP, формируют в клетках дрожжей S. cerevisiaeагрегаты.
3. Агрегаты, формируемые фрагментом белка VTG2 с 140-й по 497-ю аминокислоту, проявляют частичную устойчивость к 1% SDS.
2. Фрагменты белка VTG2 с 140-й по 497-ю аминокислоту, с 696-й по 1019-ю аминокислоту и с 1456-й по 1517-ю аминокислоту, слитые с YFP, формируют в клетках дрожжей S. cerevisiaeагрегаты.
3. Агрегаты, формируемые фрагментом белка VTG2 с 140-й по 497-ю аминокислоту, проявляют частичную устойчивость к 1% SDS.
ИЛИ
Поиск аналога
📕 Список литературы
🛒 Оформить заказ
⚡ Работу высылаем в течении 5 минут после оплаты.