Введение
Цели и задачи 4
Обзор литературы 5
Липопротеины и транспорт липидов 5
Механизмы атерогенеза 7
Роль макрофагов в атерогенезе 11
Факторы эффективности эффероцитоза 14
Стратегии изучения и доступные модели исследования эффероцитоза 16
Материалы и методы 17
Работа с клеточной линией ТНР-1 17
Выделение мононуклеаров из периферической крови 18
Работа с клеточной линией Jurkat 19
Оценка эффективности эффероцитоза 20
Проточная цитометрия 22
Использование перфузионных камер и конфокальная микроскопия 23
Расчеты и статистическая обработка 25
Выравнивание нуклеотидных последовательностей 26
Результаты 26
Опыт для подбора оптимальных условий индукции апоптоза клеток линии Jurkat 26
Детекция эффероцитоза с помощью метода проточной цитометрии 27
Опыт по оценке зависимости эффективности эффероцитоза от времени 29
Серия опытов на ТНР-1 и РВМС с положительным и отрицательным контролем 31
Сравнение промоторных областей генов mertk человека и мыши 33
Обсуждение 34
Выводы 37
Список литературы 38
Постиндустриальное общество, помимо технического прогресса, озабочено также вопросами долголетия и улучшения качества жизни. Некоторые заболевания удалось победить с помощью инновационных мер профилактики и терапии, тогда как другие вышли на авансцену угроз мирового здравоохранения. На протяжении нескольких десятилетий заболевания сердечно-сосудистой системы лидируют в списке причин смерти людей по всему миру, и один из основных факторов риска их возникновения — это атеросклероз (Mozaffarian и др., 2014; www.who.int; Frostegard, 2013). Это заболевание характеризуется хроническим воспалительным процессом, затрагивающим преимущественно внутреннюю оболочку, или интиму, крупных и средних артерий, в которой образуются т.н. атеросклеротические бляшки. При разрастании они могут затруднять кровоток, а при разрушении — вызвать тромбообразование, закупорку сосуда и смерть. На начальных стадиях в интиму сосуда проникают богатые холестерином липопротеины низкой плотности (LDL). Их накопление вызывает активацию провоспалительных сигнальных путей эндотелиоцитов и экспрессию ими факторов адгезии моноцитов (Linton и др., 2019). Последние мигрируют в интиму и дифференцируются в макрофаги для захвата LDL с помощью фагоцитоза или рецептор-опосредованного эндоцитоза (Woollard и др., 2010). Кроме того, под действием воспалительных факторов и макрофаги, и эндотелиоциты вырабатывают активные формы кислорода, которые окисляют или иным образом модифицируют LDL (mLDL). Такие липопротеины сами по себе становятся мощным провоспалительным фактором, что и знаменует «порочный круг» патогенеза атеросклероза (Linton и др., 2019).
Несмотря на то, что почти любая клетка животного организма может синтезировать холестерин, ни одна из них не может полностью его катаболизировать, поэтому для клеток существует опасность избытка холестерина. Перенасыщение цистерн ЭПР макрофага эфирами холестерина блокирует работу рецептора нативных LDL (LDLR), однако такая отрицательная обратная связь не действует в случае рецепторов mLDL, что приводит к неконтролируемому поглощению последних и гибели макрофага в результате стресса ЭПР и нарушения фолдинга белков (Rogacev и др., 2012; Tabas и Ron., 2011). В норме макрофаги захватывают
погибшие клетки животного организма в ходе процесса, называемого эффероцитозом. При атеросклерозе эффективность эффероцитоза критически важна: погибшие апоптозом макрофаги, составляющие ядро атеросклеротической бляшки, могут претерпеть вторичный некроз, который определяет нестабильность бляшки и риск осложнений заболевания вплоть до летального исхода (Shao и др., 2012). Но данные, полученные при изучении более поздних атеросклеротических поражений, свидетельствуют о неэффективности в них эффероцитоза (Schrijvers и др., 2005).
Цели и задачи
Перечисленные факты определили цель настоящего исследования — разработку физиологически релевантной тест-системы, позволяющей исследовать эффективность эффероцитоза и его механизмы.
Для достижения этой цели необходимо было выполнить следующие задачи:
1. Подобрать оптимальные условия для индукции апоптоза клеток Т-лимфобластного лейкоза человека (Jurkat) с помощью камптотецина;
2. Подобрать оптимальное время контакта фагоцитов, полученных из клеток моноцитарного лейкоза человека (ТНР-1) и моноцитов периферической крови, и апоптотических клеток;
3. Детектировать эффероцитоз с помощью метода проточной цитометрии;
4. Выбрать метод культивирования для наблюдения за живыми клетками и визуализации эффероцитоза с помощью конфокальной микроскопии;
5. Провести количественный анализ эффективности эффероцитоза.
1. Суточная инкубация в среде с конечной концентрацией камптотецина 10 мкМ позволяет получать стабильную фракцию апоптотических Jurkat;
2. Контакт фагоцитов и клеток-мишеней в течение 90 минут оптимален для исследования эффероцитоза в условиях длительной пробоподготовки;
3. Тест-система может быть использована для детекции эффероцитоза с помощью проточной цитометрии;
4. Использование перфузионной камеры позволяет осуществлять прижизненную визуализацию эффероцитоза;
5. Количественный анализ эффективности эффероцитоза выявил различия в регуляции экспрессии человеческой и мышиной Mer тирозин-киназы, участвующей в эффероцитозе;
