Введение 4
Глава 1. Обзор литературы 6
1.1 Структура бактериальных родопсинов 6
1.2 Фотоизомеризация хромофора 6
1.3 Фотоцикл бактериородопсина 8
1.4 Исследование спектральных характеристик основного состояния
и интермедиатов фотоцикла бактериородопсина 9
1.4.1 Спектры комбинационного рассеяния 9
1.4.2 Спектры инфракрасного поглощения (ИК спектры) 13
1.4.3 Флуоресценция бактериородопсина 14
1.4.4 Сравнение фотоциклов бактериородопсина и
археородопсина-3. 14
1.5 Характеристики флуоресценции археородопсина-3 и его
мутантных форм 15
1.6 Предложенные модели механизма потенциал-зависимости
флуоресценции археородопсина-3 18
1.7 Модификация стабильности О-состояния в бактериородопсине
путем введения аминокислотных замен 20
Глава 2. Методы 22
2.1 Экспериментальные методы 22
2.2 Теоретические методы 23
2.2.1 Получение трехмерных структур белков 23
2.2.2 Расчет спектральных свойств 24
2.2.3 Расчет pKa аминокислот 24
2.2.4 Расчет энергии Гиббса между состояниями белка 24
Глава 3. Результаты и обсуждение 27
3.1 Анализ экспериментальных результатов 27
3.2 Анализ результатов компьютерного моделирования 38
Выводы 45
Благодарности 47
Список литературы 48
Приложение А. Праймеры для мутагенеза 54
Приложение Б. Использованные буферы 55
Приложение В. Результаты секвенирваний
Археородопсин-3 - трансмембранный белок из семейства бактериальных родопсинов, применяемый в оптогенетике для визуализации активности нейронов [1—3]. Данная область применения обеспечена специфическими характеристиками флуоресценции археородопсина-3. Интенсивность флуоресценции данного белка линейно зависит от величины потенциала внешнего электрического поля. Таким образом, интенсивность флуоресценции археоро¬допсина-3, функционирующего в мембране нейрона, изменяется при изменении величины мембранного потенциала нейрона, что позволяет проводить мониторинг активности нейронов при помощи оптических методов.
Важной задачей в оптогенетике является создание белков на основе археородопсина-3 с модифицированными характеристиками флуоресцентного сигнала. Основная часть исследований, посвященных разработке производных археородопсина-3 для оптогенетических применений, направлена на достижение следующих целей: 1) повышение интенсивности флуоресцентного сигнала; 2) повышение чувствительности интенсивности флуоресцентного сигнала к изменению величины мембранного потенциала; 3) сдвиг спектра поглощения белка в длинноволновой диапазон. Проводимые на сегодняшний день исследования основаны на переборе большого количества вариантов мутантных форм белка при помощи методов направленной эволюции и случайного мутагенеза. Более перспективным подходом является рациональный молекулярный дизайн, однако его применение ограничено отсутствием данных о механизме, определяющем потенциал-зависимость флуоресценции белка. В частности, необходимо определить, из какого состояния белка возникает флуоресцентный сигнал, а также механизм стабилизации этого состояния. Повышение концентрации состояния, из которого возникает флуоресценция, при помощи аминокислотных замен позволило бы увеличить интенсивность флуоресцентного сигнала. Помимо этого, необходимой задачей является определение механизма, определяющего зависимость интенсивности флуоресцентного сигнала от величины мембранного потенциала клетки.
Основной целью данного исследования стало определение механизма, отвечающего за потенциал-зависимость флуоресценции археородопсина-3 и его мутантных форм. Для достижения данной цели были поставлены и решены следующие задачи:
— Определение состояния белка, фотоактивация которого приводит к возникновению флуоресцентного сигнала (О-состояние), определение механизма стабилизации данного состояния;
— Определение механизма, определяющего потенциал-зависимость флуоресценции белка.
На основании полученных данных был предложен ряд аминокислотных замен, введение которых, согласно предложенному в работе механизму, приводит к стабилизации О-состояния археородопсина-3 и, соответственно, к повышению интенсивности флуоресцентного сигнала. На сегодняшний день проводятся работы по синтезу предложенных мутантных форм археородопсина-3 для проверки данной гипотезы.
Основные результаты работы заключаются в следующем.
1. На основе анализа экспериментально измеренных спектров комбинационного рассеяния и электронных спектров поглощения археородопсина-3 дикого типа и его мутантных форм, характеризуемых высокой интенсивностью флуоресценции, а также на основании анализа результатов компьютерного моделирования различных состояний археородопсина-3 дикого типа и его мутантных форм, была выдвинута гипотеза о стабилизации О-состояния в мутантных формах археородопсина-3, характеризуемых высокой интенсивностью флуоресценции. В рассмотренных мутантных формах белка О-состояние становится основным со-стоянием фотоцикла.
2. На основе анализа спектров возбуждения флуоресценции археородоп¬сина-3 и его мутантных форм была выдвинута гипотеза, что в рассмотренных мутантных формах археородопсина-3, характеризуемых высокой интенсивностью флуоресценции, флуоресценция возникает при фотовозбуждении основного(О) состояния белка.
3. Результаты компьютерного моделирования показали, что наблюдается корреляция между стабильностью О-состояния белка и экспериментально измеренным квантовым выходом флуоресценции белка.
4. На основании анализа результатов компьютерного моделирования и экспериментальных данных было выдвинуто предположение, что мембранный потенциал клетки влияет на концентрацию О-состояния белка, которое определяется протонированным состоянием хромофора, контриона Asp222 и депротонированным состоянием аминокислот Glu204 и Glu214, входящих в ионный замок. Таким образом, зависимость интенсивности флуоресценции археородопсина-3 и его производных от потенциала объясняется тем, что мембранный потенциал влияет на концетрацию О-состояния, при фотоактивации которого возникает флуоресцентный сигнал. Экспериментальные данные показывают, что наиболее сильной зависимостью интенсивности флуоресценции от мембранного потенциала обладают белки, для которых значение pKa Asp222 и хромофора близко к физиологическому pH=7.2, что также подтверждает гипотезу.
Также на основании результатов компьютерного моделирования ряда производных археородопсина-3 были предложены аминокислотные замены, которые приводят к повышению pKa контриона Asp222 и, согласно гипотезе, к повышению концетрации О-состоянии повышению интенсивности флуоресценции. Дальнейшим направлением исследований является более детальное изучение механизма флуоресценции археородопсина-3 и его производных при помощи методов спектроскопии с высоким временным разрешением.
