Введение 5
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1. Сигнальные белки семейства PII фотосинтезирующих организмов 7
1.2. Структура и функции PII-белков у цианобактерий 8
1.2.1. Структура PII-белков у цианобактерий 8
1.2.2. Контроль белков-транспортеров 10
1.2.3. Контроль биосинтеза аргинина и цианофицина 11
1.2.4. Контроль глобального регулятора транскрипции NtcA через взаимодействие с
белком-адаптером PipX 14
1.2.5. Регуляция фосфоенолпируваткарбоксилазы 15
1.2.6. Контроль биосинтеза жирных кислот 16
1.3. Структура и функции PII-белков у растений 17
1.3.1. Структура PII-белков у растений 17
1.3.2. Взаимодействие с NAGK 18
1.3.3. Контроль биосинтеза жирных кислот 19
1.3.4. Участие в поддержании симбиотических систем 19
Глава 2. Материалы и методы 21
2.1. Объект исследования 21
2.2. Условия культивирования 21
2.3. Количественный анализ экспрессии генов 22
2.3.1. Выделение тотальной РНК 22
2.3.2. Синтез комплементарной ДНК 23
2.3.3. Количественная ПЦР в режиме реального времени 23
2.4. Измерение концентрации хлорофилла 25
2.5. Выделение белков и определение их концентрации 25
2.6. Определение внутриклеточного содержания свободного аргинина 26
2.7. Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантных белков 26
2.8. Оценка активности фермента NAGK in vitro 28
2.9. Оценка активности фермента NAGK in vivo 29
2.10. Статистическая обработка данных 29
Глава 3. Результаты 31
3.1. Биоинформационный анализ первичных последовательностей DsaNAGK и DsaPII 31
3.2. Характеристика активности DsaNAGK in vitro 36
3.3. Характеристика активности DsaNAGK in vivo 41
3.3.1. Рост D. salina при разных концентрациях NaCl в среде 41
3.3.2. Зависимость активности и синтеза DsaNAGK в клетках, выращенных при разных
концентрациях NaCl 42
3.3.3. Активность и экспрессия DsaNAGK в условиях голодания по азоту 44
3.3.4. Активность и экспрессия CrNAGK в условиях голодания по азоту 47
Глава 4. Обсуждение результатов 49
Заключение 53
Выводы 54
Благодарности 55
Список литературы 56
В процессах метаболизма азота синтез аргинина играет важную роль, так как аргинин представляет собой не только незаменимую аминокислоту для биосинтеза белков, но также выступает предшественником в образовании полиаминов и окиси азота, которые, в свою очередь, участвуют в развитии микроорганизмов и их адаптации к стрессовым условиям. Ключевым ферментом биосинтеза аргинина у представителей Chlorophyta является N-ацетил-Ь-глутаматкиназа (NAGK). При этом среди Cyanobacteria и Archaeplastida ее активность контролируется сигнальным белком из семейства PII. Следует отметить, что первоначально ген, кодирующий PII-белок, не был выявлен у галофильной водоросли Dunaliella salina. Однако проведенное в 2020 году повторное секвенирование генома с использованием усовершенствованных технологий позволило показать наличие указанного гена у этой одноклеточной зеленой водоросли (Polle et al., 2020).
Суперсемейство белков PII включает сигнальные белки, которые обнаружены во всех трех доменах жизни. Канонические PII-белки воспринимают энергетический статус клетки посредством конкурентного связывания АТФ и АДФ, а также баланс углерода/азота посредством связывания 2-оксоглутарата (2-OG). Представители Archaeplastida унаследовали сигнальные PII-белки от предкового цианобактериального эндосимбионта. В ходе эволюции PII-белки растений приобрели чувствительность к глутамину, которая связана с появлением С-концевого расширения, называемого Q-петлей (Chellamuthu et al., 2014). Эта структура присутствует во всех PII-белках Chloroplastida. Сенсорные и регуляторные свойства PII-белков систематически исследовались у различных штаммов водорослей (красных, зеленых и др.). Так, сравнение этих белков у организмов с оксигенным фотосинтезом - цианобактерий, красных водорослей, Chlorophyta и высших растений - позволило понять, что они сочетают в себе высокую консервативность наравне с адаптивностью к особенностям метаболизма. Например, для представителей как Cyanobacteria, так и Archaeplastida показана высокая консервативность строения и функций фермента N-ацетил-Ь-глутаматкиназы (NAGK), которая контролирует биосинтез аргинина и выступает одной из основных мишеней PII-белка. Однако вопрос о вовлечении PII-белка в контроль биосинтеза аргинина у D. salina оставался открытым.
Цель работы - охарактеризовать свойства и механизмы регуляции ключевого фермента биосинтеза аргинина N-ацетил-Ь-глутаматкиназы у галофильной одноклеточной зеленой водоросли D. salina.
Задачи работы:
1. Используя методы клонирования и аффинной хроматографии, получить рекомбинантную N-ацетил-Ь-глутаматкиназу (DsaNAGK) D. salina.
2. Охарактеризовать кинетические параметры DsaNAGK и сравнить их со свойствами изученных ранее N-ацетил-Ь-глутаматкиназ.
3. Оценить роль PII-белка в контроле активности DsaNAGK.
4. Проанализировать изменение уровней экспрессии и активности N-ацетил-Ь- глутаматкиназы in vivo в клетках D. salina при росте в средах с разными концентрациями хлорида натрия и в условиях голодания по источнику азота.
Анализ свойств и механизмов регуляции ключевого фермента биосинтеза аргинина N-ацетил-К-глутаматкиназы у галофильной одноклеточной зеленой водоросли D. salina позволил прийти к следующему заключению.
Впервые для представителей галофильных одноклеточных фотосинтезирующих эукариотических микроорганизмов охарактеризован белок из консервативного семейства ферментов, вовлеченных в синтез аргинина, и установлено, что DsaNAGK ингибируется аргинином по принципу обратной связи, а значит относится к аргинин-чувствительным N- ацетил-Ь-глутаматкиназам. Сравнение каталитической активности DsaNAGK с другими одноклеточными зелеными водорослями позволяет говорить о сходных ферментативных возможностях, а имеющиеся отличия, вероятнее всего, отражают особенности метаболизма разных представителей.
Полученные данные подтверждают высказанную ранее в нашей лаборатории идею о том, что на протяжении всей эволюции фототрофов с оксигенным типом фотосинтеза - от цианобактерий до Archaeplastida - N-ацетил-Ь-глутаматкиназа является наиболее консервативной клеточной мишенью PII-белков.
Кроме того, нами установлено, что DsaNAGK регулируется на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях, и голодание по источнику азота приводит к увеличению активности фермента. Последнее обстоятельство, по нашему мнению, может отражать общую стратегию в адаптации одноклеточных зеленых водорослей, поскольку данный феномен выявлен нами также для Chlamydomonas reinhardtii. Дальнейшие исследования с привлечение дополнительных объектов позволят подтвердить или опровергнуть наше предположение.
