Изучение особенностей метаболомного профиля растений с противовирусной и противобактериальной активностью, полученных в культуре in vitro, методами хроматографии и капиллярного электрофореза
|
ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 7
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1 Перспективы растений рода Iris L 9
1.2 Биотехнологии в производстве лекарственного растительного сырья 11
1.3 Основные метаболиты рода Iris L 12
1.3.1 Фенольные соединения Iris L 13
1.3.1.1 Пробоподготовка растительных объектов к хроматографическому и электрофоретическому анализу для изучения профилей фенольных соединений 15
1.3.1.2 Определение фенольных соединений хроматографическими методами 18
1.3.2 Аминокислоты. Свободные аминокислоты и их роль в растении 21
1.3.2.1 Пробоподготовка растительных объектов к анализу хроматографическими и электрофоретическими методами для определения свободных аминокислот 22
1.3.2.2 Хроматографические и электрофоретические подходы к определению аминокислот 23
1.3.3 Органические кислоты. Короткоцепочечные органические кислоты и их роль в растении 24
1.3.3.1 Пробоподготовка растительных объектов к анализу хроматографическими и электрофоретическими методами для определения органических кислот 25
1.3.3.2 Определение короткоцепочечных органических кислот методами хроматографии и капиллярного электрофореза 26
1.4 Дизайн эксперимента в оптимизации условий пробоподготовки 29
2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 34
2.1 Материалы и реактивы 34
2.2 Оборудование 34
2.3 Объект исследования 35
2.4 Приготовление растворов 36
2.4.1 Приготовление буферных растворов 36
2.4.2 Приготовление растворов стандартов полифенолов и аминокислот 37
2.4.3 Приготовление раствора для проявления полифенолов и аминокислот в ВЭТСХ 37
2.5 Методы исследования 38
2.5.1 Условия выращивания Iris sibirica и Iris ensata методами биотехнологии 38
2.5.2 Условия определения полифенолов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с УФ и масс-спектрометрическим детектированием 39
2.5.3 Условия определения аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с УФ и масс-спектрометрическим детектированием 40
2.5.4 Условия электрофоретического разделения анионов органических кислот 41
2.5.5 Подготовка растительных объектов к хроматографическому и электрофоретическому анализу 41
2.5.6 Получение дансильных производных аминокислот 43
3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 44
3.1 Получение характеристических профилей фенольных соединений экстрактов листьев Iris sibirica L. методом обращенно-фазовой ВЭЖХ 46
3.1.1 Выбор условий хроматографического разделения фенольных соединений метанольных экстрактов Iris sibirica L. и Iris ensata L 46
3.1.2 Поиск оптимальных условий извлечения фенольных соединений из Iris sibirica L 47
3.1.3 Получение хроматографических профилей флавоноидов Iris sibirica L. Идентификация флавоноидов методом хромато-масс-спектрометрии 51
3.2 Получение характеристических профилей полифенолов в экстрактах листьев биотехнологического сырья Iris ensata L. методом ВЭТСХ 60
3.2.1 Выбор условий разделения полифенолов в метанольных экстрактах листьев Iris ensata L. методом ВЭТСХ 60
3.2.2 Получение характеристических профилей биотехнологического сырья методом ВЭТСХ 62
3.3 Получение характеристических профилей аминокислот в экстрактах листьев I. sibirica L. методом обращенно-фазовой ВЭЖХ 66
3.3.1 Разделение дансильных производных аминокислот методом ОФ ВЭЖХ 66
3.3.2 Поиск условий извлечения аминокислот из листьев биотехнологического сырья I. sibirica L 68
3.3.3 Получение характеристических профилей аминокислот листьев биотехнологического сырья I. sibirica L 69
3.4 Получение характеристических профилей органических кислот в экстрактах листьев I. sibirica L. методом КЭ 72
3.4.1 Выбор условий электрофоретического определения органических кислот. Извлечение органических кислот из растительного сырья 72
3.4.2 Получение характеристических профилей органических кислот растительного сырья I. sibirica L 76
ВЫВОДЫ 80
БЛАГОДАРНОСТИ И СВЕДЕНИЯ О РАБОТЕ 81
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 82
ВВЕДЕНИЕ 7
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1 Перспективы растений рода Iris L 9
1.2 Биотехнологии в производстве лекарственного растительного сырья 11
1.3 Основные метаболиты рода Iris L 12
1.3.1 Фенольные соединения Iris L 13
1.3.1.1 Пробоподготовка растительных объектов к хроматографическому и электрофоретическому анализу для изучения профилей фенольных соединений 15
1.3.1.2 Определение фенольных соединений хроматографическими методами 18
1.3.2 Аминокислоты. Свободные аминокислоты и их роль в растении 21
1.3.2.1 Пробоподготовка растительных объектов к анализу хроматографическими и электрофоретическими методами для определения свободных аминокислот 22
1.3.2.2 Хроматографические и электрофоретические подходы к определению аминокислот 23
1.3.3 Органические кислоты. Короткоцепочечные органические кислоты и их роль в растении 24
1.3.3.1 Пробоподготовка растительных объектов к анализу хроматографическими и электрофоретическими методами для определения органических кислот 25
1.3.3.2 Определение короткоцепочечных органических кислот методами хроматографии и капиллярного электрофореза 26
1.4 Дизайн эксперимента в оптимизации условий пробоподготовки 29
2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 34
2.1 Материалы и реактивы 34
2.2 Оборудование 34
2.3 Объект исследования 35
2.4 Приготовление растворов 36
2.4.1 Приготовление буферных растворов 36
2.4.2 Приготовление растворов стандартов полифенолов и аминокислот 37
2.4.3 Приготовление раствора для проявления полифенолов и аминокислот в ВЭТСХ 37
2.5 Методы исследования 38
2.5.1 Условия выращивания Iris sibirica и Iris ensata методами биотехнологии 38
2.5.2 Условия определения полифенолов методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с УФ и масс-спектрометрическим детектированием 39
2.5.3 Условия определения аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с УФ и масс-спектрометрическим детектированием 40
2.5.4 Условия электрофоретического разделения анионов органических кислот 41
2.5.5 Подготовка растительных объектов к хроматографическому и электрофоретическому анализу 41
2.5.6 Получение дансильных производных аминокислот 43
3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 44
3.1 Получение характеристических профилей фенольных соединений экстрактов листьев Iris sibirica L. методом обращенно-фазовой ВЭЖХ 46
3.1.1 Выбор условий хроматографического разделения фенольных соединений метанольных экстрактов Iris sibirica L. и Iris ensata L 46
3.1.2 Поиск оптимальных условий извлечения фенольных соединений из Iris sibirica L 47
3.1.3 Получение хроматографических профилей флавоноидов Iris sibirica L. Идентификация флавоноидов методом хромато-масс-спектрометрии 51
3.2 Получение характеристических профилей полифенолов в экстрактах листьев биотехнологического сырья Iris ensata L. методом ВЭТСХ 60
3.2.1 Выбор условий разделения полифенолов в метанольных экстрактах листьев Iris ensata L. методом ВЭТСХ 60
3.2.2 Получение характеристических профилей биотехнологического сырья методом ВЭТСХ 62
3.3 Получение характеристических профилей аминокислот в экстрактах листьев I. sibirica L. методом обращенно-фазовой ВЭЖХ 66
3.3.1 Разделение дансильных производных аминокислот методом ОФ ВЭЖХ 66
3.3.2 Поиск условий извлечения аминокислот из листьев биотехнологического сырья I. sibirica L 68
3.3.3 Получение характеристических профилей аминокислот листьев биотехнологического сырья I. sibirica L 69
3.4 Получение характеристических профилей органических кислот в экстрактах листьев I. sibirica L. методом КЭ 72
3.4.1 Выбор условий электрофоретического определения органических кислот. Извлечение органических кислот из растительного сырья 72
3.4.2 Получение характеристических профилей органических кислот растительного сырья I. sibirica L 76
ВЫВОДЫ 80
БЛАГОДАРНОСТИ И СВЕДЕНИЯ О РАБОТЕ 81
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 82
В последнее время отмечается значительный интерес к растительным объектам - ведётся поиск лекарственных растений, обладающих высокой биологической активностью, а также новых природных молекул, способных помочь человеку в борьбе с различными заболеваниями. Растения рода Iris L. давно и успешно зарекомендовали себя в данном аспекте, они широко используются в традиционной медицине для борьбы с бактериальными и вирусными инфекциями. Экстракты на их основе обладают пестицидными, антибактериальными, противовирусными, антиоксидантными, противовоспалительными, противоопухолевыми благодаря накоплению в этих растениях рода Iris L. широкого спектра биологически активных веществ (флавоноиды, аминокислоты, органические кислоты и др.).
Однако, некоторые неизученные виды Iris L., например, Iris sibirica L. и Iris ensata L., относятся к исчезающим и занесены в Красные книги регионов РФ. Использование краснокнижных растений для получения лекарственных препаратов не представляется возможным. Решением проблемы являются биотехнологические подходы, такие как микроразмножение и аэропонные технологии, позволяющие получать лекарственное растительное сырьё высокого качества в необходимых количествах в короткие сроки и в любое время года. Важной особенностью биотехнологических подходов является возможность направленного биосинтеза биологически активных веществ и получения культур с высоким содержанием вторичных метаболитов. К одним из значимых регуляторов их накопления в клеточных культурах растений относятся такие компоненты питательных сред, как гормоны и гормоноподобные соединения.
Для оптимизации условий выращивания требуются методики эффективного контроля биотехнологического сырья . Однако, в литературе отсутствует единая схема пробоподготовки и анализа растительных объектов, а методы контроля получаемого сырья, закреплённые в нормативных документах, устарели и не позволяют полно оценить содержание природных биологически активных веществ для разработки биотехнологии получения растительного сырья. Актуальной задачей является разработка эффективных аналитических подходов для определения и идентификации индивидуальных веществ в растительных объектах. Эта задача может быть успешно решена с применением хроматографических (ВЭЖХ-УФ, ВЭЖХ-МС) и электрофоретических методов, которые уже зарекомендовали себя при определении биологически активных веществ в сложных природных матрицах, позволяющие проводить как целевое, так и нецелевое профилирование аналитов.
Объектом данного исследования выступало биотехнологическое сырьё Iris sibirica L. и Iris ensata L., выращенное в аэропонике и на питательных средах с различным содержанием фитогормонов цитокинина 6-бензиламинопурина (6-БАП) и ауксина а-нафтилуксусной кислоты (а-НУК).
Целью работы являлась разработка подходов к селективному извлечению фенольных соединений, аминокислот и органических кислот из биотехнологического сырья видов Iris L. с дальнейшим получением хроматографических и электрофоретических профилей биологически активных аналитов и выявлением закономерностей их изменений в зависимости от содержания фитогормонов в питательных средах.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1. Выбор условий селективного разделения биологически активных компонентов: флавоноидов методом ВЭЖХ-УФ-МС/МС и ВЭТСХ, аминокислот методом ВЭЖХ-МС/МС, органических кислот методом КЭ- УФ.
2. Разработка регламента подготовки проб растительных объектов Iris L. для извлечения аналитов, включающая в себя выбор экстрагентов и выявление факторов, влияющих на эффективность экстракции аналитов.
3. Целевое и нецелевое профилирование биологически активных веществ Iris L. в выбранных условиях.
4. Идентификация фенольных соединений методом жидкостной хромато-масс- спектрометрии с электрораспылительной ионизацией.
5. Выявление закономерностей накопления определяемых биологически активных веществ в биотехнологическом сырье Iris L. в зависимости от гормонального состава питательной среды.
Однако, некоторые неизученные виды Iris L., например, Iris sibirica L. и Iris ensata L., относятся к исчезающим и занесены в Красные книги регионов РФ. Использование краснокнижных растений для получения лекарственных препаратов не представляется возможным. Решением проблемы являются биотехнологические подходы, такие как микроразмножение и аэропонные технологии, позволяющие получать лекарственное растительное сырьё высокого качества в необходимых количествах в короткие сроки и в любое время года. Важной особенностью биотехнологических подходов является возможность направленного биосинтеза биологически активных веществ и получения культур с высоким содержанием вторичных метаболитов. К одним из значимых регуляторов их накопления в клеточных культурах растений относятся такие компоненты питательных сред, как гормоны и гормоноподобные соединения.
Для оптимизации условий выращивания требуются методики эффективного контроля биотехнологического сырья . Однако, в литературе отсутствует единая схема пробоподготовки и анализа растительных объектов, а методы контроля получаемого сырья, закреплённые в нормативных документах, устарели и не позволяют полно оценить содержание природных биологически активных веществ для разработки биотехнологии получения растительного сырья. Актуальной задачей является разработка эффективных аналитических подходов для определения и идентификации индивидуальных веществ в растительных объектах. Эта задача может быть успешно решена с применением хроматографических (ВЭЖХ-УФ, ВЭЖХ-МС) и электрофоретических методов, которые уже зарекомендовали себя при определении биологически активных веществ в сложных природных матрицах, позволяющие проводить как целевое, так и нецелевое профилирование аналитов.
Объектом данного исследования выступало биотехнологическое сырьё Iris sibirica L. и Iris ensata L., выращенное в аэропонике и на питательных средах с различным содержанием фитогормонов цитокинина 6-бензиламинопурина (6-БАП) и ауксина а-нафтилуксусной кислоты (а-НУК).
Целью работы являлась разработка подходов к селективному извлечению фенольных соединений, аминокислот и органических кислот из биотехнологического сырья видов Iris L. с дальнейшим получением хроматографических и электрофоретических профилей биологически активных аналитов и выявлением закономерностей их изменений в зависимости от содержания фитогормонов в питательных средах.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1. Выбор условий селективного разделения биологически активных компонентов: флавоноидов методом ВЭЖХ-УФ-МС/МС и ВЭТСХ, аминокислот методом ВЭЖХ-МС/МС, органических кислот методом КЭ- УФ.
2. Разработка регламента подготовки проб растительных объектов Iris L. для извлечения аналитов, включающая в себя выбор экстрагентов и выявление факторов, влияющих на эффективность экстракции аналитов.
3. Целевое и нецелевое профилирование биологически активных веществ Iris L. в выбранных условиях.
4. Идентификация фенольных соединений методом жидкостной хромато-масс- спектрометрии с электрораспылительной ионизацией.
5. Выявление закономерностей накопления определяемых биологически активных веществ в биотехнологическом сырье Iris L. в зависимости от гормонального состава питательной среды.
ВЫВОДЫ
1. Выбраны условия хроматографического и хроматомасс-спектрометрического определения флавоноидов и аминокислот в экстрактах Iris L. методом ОФ ВЭЖХ с градиентным режимом элюирования.
2. Разработаны схемы подготовки проб для эффективного извлечения флавоноидов и аминокислот из листьев Iris L. c применением дизайна эксперимента. Выявлены основные факторы, влияющие на эффективность экстракции аналитов (взаимодействие температуры и времени нагрева, а также содержание метанола - для флавоноидов; температура нагрева и содержание метанола - для аминокислот) и установлены оптимальные условия извлечения: для полифенолов - экстракция 100% метанолом при 65°С в течение 15 мин, для аминокислот - экстракция 50% метанолом с добавкой 100 мкл 11С'%/Ш при 70оС в течение 20 мин.
3. Получены характеристические профили флавоноидов и аминокислот методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием и профили органических кислот методом КЗЭ в экстрактах биотехнологического сырья Iris L.
4. Проведена предварительная идентификация фенольных соединений (37 соединений) методом ОФ ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией. Они относятся к классам изофлавоноидов, ксантонов, флавонов и фенольных кислот.
5. Выявлены закономерности накопления аналитов в зависимости от гормонального состава питательной среды. Показано, что при концентрации фитогормона БАП в питательной среде 7.5 мкМ с добавкой 1 мкМ НУК наблюдается максимальная концентрация основных флавоноидов в экстрактах листьев Iris L.
6. Разработан экспрессный вариант контроля биотехнологического сырья по содержанию флавоноидов методом ВЭТСХ с денситометрическим детектированием.
1. Выбраны условия хроматографического и хроматомасс-спектрометрического определения флавоноидов и аминокислот в экстрактах Iris L. методом ОФ ВЭЖХ с градиентным режимом элюирования.
2. Разработаны схемы подготовки проб для эффективного извлечения флавоноидов и аминокислот из листьев Iris L. c применением дизайна эксперимента. Выявлены основные факторы, влияющие на эффективность экстракции аналитов (взаимодействие температуры и времени нагрева, а также содержание метанола - для флавоноидов; температура нагрева и содержание метанола - для аминокислот) и установлены оптимальные условия извлечения: для полифенолов - экстракция 100% метанолом при 65°С в течение 15 мин, для аминокислот - экстракция 50% метанолом с добавкой 100 мкл 11С'%/Ш при 70оС в течение 20 мин.
3. Получены характеристические профили флавоноидов и аминокислот методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием и профили органических кислот методом КЗЭ в экстрактах биотехнологического сырья Iris L.
4. Проведена предварительная идентификация фенольных соединений (37 соединений) методом ОФ ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией. Они относятся к классам изофлавоноидов, ксантонов, флавонов и фенольных кислот.
5. Выявлены закономерности накопления аналитов в зависимости от гормонального состава питательной среды. Показано, что при концентрации фитогормона БАП в питательной среде 7.5 мкМ с добавкой 1 мкМ НУК наблюдается максимальная концентрация основных флавоноидов в экстрактах листьев Iris L.
6. Разработан экспрессный вариант контроля биотехнологического сырья по содержанию флавоноидов методом ВЭТСХ с денситометрическим детектированием.
Подобные работы
- Изучение особенностей метаболомного профиля растений с противовирусной и противобактериальной активностью, полученных в культуре in vitro, методами хроматографии и капиллярного электрофореза
Магистерская диссертация, химия. Язык работы: Русский. Цена: 4815 р. Год сдачи: 2022