Помощь студентам в учебе
Полислойные покрытия на основе наночастиц золота и полимеров при электрофоретическом разделении биологически активных соединений
|
Список используемых сокращений 4
ВВЕДЕНИЕ 6
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 8
1.1 Метод капиллярного электрофореза 8
1.2 Покрытия стенок кварцевого капилляра 12
1.2.1 Покрытия капилляров на основе наночастиц золота 14
1.2.2 Формирование многослойных покрытий на основе наночастиц золота... 19
1.3 Полимеры и наночастицы в качестве покрытий для хирального разделения в условиях капиллярного электрофореза 23
1.3.1 Покрытия стенок капилляра на основе полимеров для хирального
разделения в КЭ 23
1.3.2 Применение альбумина в качестве хирального модификатора стенок
капилляра 29
1.3.3 Покрытия капилляров на основе наночастиц для хирального разделения 32
1.3.4 Применение наночастиц золота как компонента покрытий для
хирального разделения 34
1.4 Характеристика исследуемых в работе наночастиц и полимеров 39
1.5 Характеристика исследуемых в работе аналитов 42
1.5.1 Аминокислоты 42
1.5.2 fi-блокаторы 43
2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 46
2.1 Аппаратурное оформление 46
2.2 Реактивы и материалы 47
2.3 Синтез, концентрирование и очистка наночастиц золота 48
2.3.1 Цитрат-стабилизированные наночастицы золота (цНЧЗ) 48
2.3.2 Наночастицы золота, модифицированные бычьим сывороточным
альбумином (цНЧЗ-БСА) 49
2.4 Приготовление стандартных растворов аналитов 49
2.5 Приготовление буферных растворов для проведения электрофоретических
экспериментов 50
2.6 Приготовление рабочих растворов модификаторов 51
2.7 Условия подготовки и модификации внутренней поверхности кварцевого капилляра 51
3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 54
3.1 Синтез и характеристика наночастиц золота 56
3.1.1 Получение и характеристика цНЧЗ 56
3.1.2 Получение и характеристика цНЧЗ-БСА 58
3.2. Формирование многослойных покрытий на основе ПДАДМАХ, цНЧЗ и БСА .. 59
3.2.1 Оптимизация условий формирования первого слоя покрытия на основе
ПДАДМАХ и его характеристика 60
3.2.2 Получение и применение хиральных двухслойных покрытий на основе
ПДАДМАХ и цНЧЗ-БСА 63
3.2.3 Получение и применение полислойных покрытий, полученных путем
послойного нанесения ПДАДМАХ и цНЧЗ с последующей постфункционализацией альбумином 65
3.2.3.1 Трехслойные покрытия ПДАДМАХ-цНЧЗ-БСА 65
3.2.3.2 Пятислойные покрытия на основе ПДАДМАХ, цНЧЗ и БСА 72
3.3 Формирование пятислойных покрытий на основе ПЛЛ, цНЧЗ и БСА 77
ВЫВОДЫ 82
Благодарности 84
Список используемой литературы 85
ВВЕДЕНИЕ 6
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 8
1.1 Метод капиллярного электрофореза 8
1.2 Покрытия стенок кварцевого капилляра 12
1.2.1 Покрытия капилляров на основе наночастиц золота 14
1.2.2 Формирование многослойных покрытий на основе наночастиц золота... 19
1.3 Полимеры и наночастицы в качестве покрытий для хирального разделения в условиях капиллярного электрофореза 23
1.3.1 Покрытия стенок капилляра на основе полимеров для хирального
разделения в КЭ 23
1.3.2 Применение альбумина в качестве хирального модификатора стенок
капилляра 29
1.3.3 Покрытия капилляров на основе наночастиц для хирального разделения 32
1.3.4 Применение наночастиц золота как компонента покрытий для
хирального разделения 34
1.4 Характеристика исследуемых в работе наночастиц и полимеров 39
1.5 Характеристика исследуемых в работе аналитов 42
1.5.1 Аминокислоты 42
1.5.2 fi-блокаторы 43
2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 46
2.1 Аппаратурное оформление 46
2.2 Реактивы и материалы 47
2.3 Синтез, концентрирование и очистка наночастиц золота 48
2.3.1 Цитрат-стабилизированные наночастицы золота (цНЧЗ) 48
2.3.2 Наночастицы золота, модифицированные бычьим сывороточным
альбумином (цНЧЗ-БСА) 49
2.4 Приготовление стандартных растворов аналитов 49
2.5 Приготовление буферных растворов для проведения электрофоретических
экспериментов 50
2.6 Приготовление рабочих растворов модификаторов 51
2.7 Условия подготовки и модификации внутренней поверхности кварцевого капилляра 51
3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 54
3.1 Синтез и характеристика наночастиц золота 56
3.1.1 Получение и характеристика цНЧЗ 56
3.1.2 Получение и характеристика цНЧЗ-БСА 58
3.2. Формирование многослойных покрытий на основе ПДАДМАХ, цНЧЗ и БСА .. 59
3.2.1 Оптимизация условий формирования первого слоя покрытия на основе
ПДАДМАХ и его характеристика 60
3.2.2 Получение и применение хиральных двухслойных покрытий на основе
ПДАДМАХ и цНЧЗ-БСА 63
3.2.3 Получение и применение полислойных покрытий, полученных путем
послойного нанесения ПДАДМАХ и цНЧЗ с последующей постфункционализацией альбумином 65
3.2.3.1 Трехслойные покрытия ПДАДМАХ-цНЧЗ-БСА 65
3.2.3.2 Пятислойные покрытия на основе ПДАДМАХ, цНЧЗ и БСА 72
3.3 Формирование пятислойных покрытий на основе ПЛЛ, цНЧЗ и БСА 77
ВЫВОДЫ 82
Благодарности 84
Список используемой литературы 85
В настоящее время большинство лекарственных препаратов реализуется в виде рацематов, хотя зачастую только один энантиомер обладает требуемым терапевтическим действием. Неактивная форма может оказывать избыточную нагрузку на организм и приводить к нежелательным побочным эффектам, вплоть до летальных исходов.
Это делает актуальным создание и развитие методик разделения и определения индивидуальных энантиомеров оптически активных соединений в биологических жидкостях. Количественное определение отдельных энантиомеров возможно методами газовой, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и капиллярного электрофореза (КЭ).
Капиллярный электрофорез выгодно отличается от других методов разделения высокой эффективностью, простотой пробоподготовки и отсутствием необходимости использования дорогостоящего оборудования и сорбентов. Для осуществления энантиоселективного разделения в КЭ требуется применение хиральных селекторов в качестве модификаторов внутренней поверхности капилляра или фонового электролита (ФЭ): циклодекстринов (ЦД), полимерных ПАВ, ионных жидкостей, белков и т.д.
Активно использующийся хиральный модификатор - альбумин, представляет собой глобулярный, стабильный, водорастворимый белок, в структуре которого имеется 2 сайта связывания лекарств. Опубликованы данные о применении альбумина для формирования динамических покрытий путем добавления модификатора в фоновый электролит для разделения энантиомеров эфедрина, норэфедрина и 1),1,-триптофана. Главный недостаток таких покрытий - необходимость присутствия хирального селектора в ФЭ из-за недостаточного количества активных центров на поверхности капилляра.
Решение данной проблемы применения альбумина для энантиоселективного разделения в КЭ возможно путем увеличение удельной поверхности капилляра, модифицируемой альбумином. Для этого используют наночастицы (НЧ), среди которых наиболее востребованы наночастицы золота (НЧЗ), характеризующиеся способностью к специфическим взаимодействиям с аналитами. Кроме того, они могут быть легко модифицированы, что позволяет придавать им хиральные свойства. Пришивка хирального селектора может проводиться путем замены лиганда на поверхности НЧЗ. Например, цитрат-стабилизированные наночастицы золота (цНЧЗ) могут использоваться как прекурсоры для дальнейшей модификации.
Таким образом, в данной работе предлагается объединить свойства НЧЗ и альбумина при создании хиральных стационарных фаз в капиллярной электрохроматографии. Это могло бы обеспечить высокую энантиоселективность покрытий стенок кварцевого капилляра за счет развитой поверхности и увеличения концентрации хирального селектора.
В работе предложены варианты формирования многослойных покрытий на основе цНЧЗ и альбумин-модифицированных наночастиц золота (цНЧЗ-БСА) с использованием поли(диаллилдиметиламмоний хлорида) (ПДАДМАХ) в качестве связующего слоя, получаемых физической адсорбцией модификаторов на стенках кварцевого капилляра.
Полученные покрытия продемонстрировали стабильность в широком диапазоне рН (2-10), а также были опробованы при анализе модельных смесей энантиомеров аминокислот и 0-блокаторов.
Это делает актуальным создание и развитие методик разделения и определения индивидуальных энантиомеров оптически активных соединений в биологических жидкостях. Количественное определение отдельных энантиомеров возможно методами газовой, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и капиллярного электрофореза (КЭ).
Капиллярный электрофорез выгодно отличается от других методов разделения высокой эффективностью, простотой пробоподготовки и отсутствием необходимости использования дорогостоящего оборудования и сорбентов. Для осуществления энантиоселективного разделения в КЭ требуется применение хиральных селекторов в качестве модификаторов внутренней поверхности капилляра или фонового электролита (ФЭ): циклодекстринов (ЦД), полимерных ПАВ, ионных жидкостей, белков и т.д.
Активно использующийся хиральный модификатор - альбумин, представляет собой глобулярный, стабильный, водорастворимый белок, в структуре которого имеется 2 сайта связывания лекарств. Опубликованы данные о применении альбумина для формирования динамических покрытий путем добавления модификатора в фоновый электролит для разделения энантиомеров эфедрина, норэфедрина и 1),1,-триптофана. Главный недостаток таких покрытий - необходимость присутствия хирального селектора в ФЭ из-за недостаточного количества активных центров на поверхности капилляра.
Решение данной проблемы применения альбумина для энантиоселективного разделения в КЭ возможно путем увеличение удельной поверхности капилляра, модифицируемой альбумином. Для этого используют наночастицы (НЧ), среди которых наиболее востребованы наночастицы золота (НЧЗ), характеризующиеся способностью к специфическим взаимодействиям с аналитами. Кроме того, они могут быть легко модифицированы, что позволяет придавать им хиральные свойства. Пришивка хирального селектора может проводиться путем замены лиганда на поверхности НЧЗ. Например, цитрат-стабилизированные наночастицы золота (цНЧЗ) могут использоваться как прекурсоры для дальнейшей модификации.
Таким образом, в данной работе предлагается объединить свойства НЧЗ и альбумина при создании хиральных стационарных фаз в капиллярной электрохроматографии. Это могло бы обеспечить высокую энантиоселективность покрытий стенок кварцевого капилляра за счет развитой поверхности и увеличения концентрации хирального селектора.
В работе предложены варианты формирования многослойных покрытий на основе цНЧЗ и альбумин-модифицированных наночастиц золота (цНЧЗ-БСА) с использованием поли(диаллилдиметиламмоний хлорида) (ПДАДМАХ) в качестве связующего слоя, получаемых физической адсорбцией модификаторов на стенках кварцевого капилляра.
Полученные покрытия продемонстрировали стабильность в широком диапазоне рН (2-10), а также были опробованы при анализе модельных смесей энантиомеров аминокислот и 0-блокаторов.
1. Синтезированы цитрат-стабилизированные наночастицы золота по методу Фримана заданного размера (13±3 нм), а также проведена их поверхностная модификация альбумином. Полученные цНЧЗ и цНЧЗ-БСА охарактеризованы методами спектрофотометрии, просвечивающей электронной микроскопии и методом динамического светорассеяния. Проведена оценка размера, концентрации суспензии и поверхностного заряда полученных наночастиц. Смещение максимума поглощения и изменение дзета-потенциала цНЧЗ-БСА по сравнению с цНЧЗ косвенно свидетельствовали о прошедшей модификации.
2. Оптимизированы условия формирования первого слоя покрытия капилляра на основе ПДАДМАХ. Показано, что полученное покрытие стабильно во всем исследуемом диапазоне рН (2-10).
3. Проведена модификация капилляра, покрытого ПДАДМАХ, с использованием БСА, цНЧЗ-БСА и цНЧЗ с последующей постфункционализацией наночастиц альбумином на поверхности капилляра. Покрытия охарактеризованы с точки зрения стабильности в различных средах, оценен рабочий диапазон рН (2-10) и получены СЭМ-снимки внутренней поверхности модифицированных капилляров.
4. Показано, что последовательное нанесение слоев модификаторов приводит к формированию более плотных покрытий, обеспечивающих возможность снижения концентрации БСА в ФЭ, необходимой для разделения энантиомеров триптофана (до 5 мкМ) и пропранолола (до 20 мкМ).
5. Оптимизированы условия внутрикапиллярной постмодификации цНЧЗ альбумином. Показано, что при проведении постмодификации 0,15 мг/мл раствором БСА в воде, образованные покрытия обеспечивают полное разделение энантиомеров пропранолола и триптофана при введении 20 мкМ добавки БСА в ФЭ.
6. Показано, что использование пятислойных покрытий ПДАДМАХ-цНЧЗ- ПДАДМАХ-цНЧЗ-БСА позволяют проводить разделение энантиомеров выбранных аналитов без введения добавки хирального селектора в ФЭ за счет формирования максимально плотных покрытий с развитой поверхностью и, следовательно, высокой концентрации хирального селектора на стенках капилляра.
7. Сформированы пятислойные покрытия ПЛЛ-цНЧЗ-ПЛЛ-цНЧЗ-БСА.
Проведена оценка стабильности покрытия при различных значениях рН, получены СЭМ-снимки внутренней поверхности модифицированного капилляра. Показано, что стационарные многослойные покрытия также обеспечивают разделение энантиомеров триптофана и пропранолола без введения добавки альбумина в ФЭ.
8. Проведено сравнение пятислойных покрытий, полученных с использованием ПДАДМАХ и поли-Ь-лизина в качестве связующих слоев. Первые оказываются более стабильными (до 120 аналитических циклов против 10 в случае использования ПЛЛ), вторые - обеспечивают существенно более низкие пределы обнаружения отдельных энантиомеров (до 30 мкг/мл) и большую эффективность и разрешение при разделении энантиомеров триптофана и пропранолола.
Результаты работы представлены в публикациях:
1. Д. В. Макеева, К. С. Антипова, Е. В. Соловьева, В. П. Моргачева, Е. А. Колобова, Л. А. Карцова. Полислойные покрытия на основе стабилизированных цитратом наночастиц золота и полидиаллилдиметиламмоний хлорида для электрофоретического разделения карбоновых кислот // Журнал аналитической химии. 2023, 78(3), 241-252.
2. В.П. Моргачева, Д.В. Макеева, Е.В. Соловьева, Е.А. Колобова, Л.А. Карцова. Новые подходы к формированию покрытий на основе альбумина и наночастиц золота для хирального разделения методом капиллярного электрофореза // Аналитика и контроль. 2023, 27 (№ 1).
Доклады по результатам исследований представлены на конференциях:
1. Школа-конференция молодых ученых в рамках симпозиума «Кинетика и
динамика сорбционных процессов», приуроченного к 150 -летию со дня рождения М.С. Цвета. Тема доклада: Трехслойное покрытие на основе цитрат-стабилизированных наночастиц золота и поли(диаллилдиметиламмоний хлорида) для электрофоретического определения карбоновых кислот (диплом II степени).
2. Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2023». Тема доклада: Разработка подходов к формированию покрытий стенок кварцевого капилляра на основе альбумина и наночастиц золота для хирального разделения методом капиллярного электрофореза (диплом I степени).
2. Оптимизированы условия формирования первого слоя покрытия капилляра на основе ПДАДМАХ. Показано, что полученное покрытие стабильно во всем исследуемом диапазоне рН (2-10).
3. Проведена модификация капилляра, покрытого ПДАДМАХ, с использованием БСА, цНЧЗ-БСА и цНЧЗ с последующей постфункционализацией наночастиц альбумином на поверхности капилляра. Покрытия охарактеризованы с точки зрения стабильности в различных средах, оценен рабочий диапазон рН (2-10) и получены СЭМ-снимки внутренней поверхности модифицированных капилляров.
4. Показано, что последовательное нанесение слоев модификаторов приводит к формированию более плотных покрытий, обеспечивающих возможность снижения концентрации БСА в ФЭ, необходимой для разделения энантиомеров триптофана (до 5 мкМ) и пропранолола (до 20 мкМ).
5. Оптимизированы условия внутрикапиллярной постмодификации цНЧЗ альбумином. Показано, что при проведении постмодификации 0,15 мг/мл раствором БСА в воде, образованные покрытия обеспечивают полное разделение энантиомеров пропранолола и триптофана при введении 20 мкМ добавки БСА в ФЭ.
6. Показано, что использование пятислойных покрытий ПДАДМАХ-цНЧЗ- ПДАДМАХ-цНЧЗ-БСА позволяют проводить разделение энантиомеров выбранных аналитов без введения добавки хирального селектора в ФЭ за счет формирования максимально плотных покрытий с развитой поверхностью и, следовательно, высокой концентрации хирального селектора на стенках капилляра.
7. Сформированы пятислойные покрытия ПЛЛ-цНЧЗ-ПЛЛ-цНЧЗ-БСА.
Проведена оценка стабильности покрытия при различных значениях рН, получены СЭМ-снимки внутренней поверхности модифицированного капилляра. Показано, что стационарные многослойные покрытия также обеспечивают разделение энантиомеров триптофана и пропранолола без введения добавки альбумина в ФЭ.
8. Проведено сравнение пятислойных покрытий, полученных с использованием ПДАДМАХ и поли-Ь-лизина в качестве связующих слоев. Первые оказываются более стабильными (до 120 аналитических циклов против 10 в случае использования ПЛЛ), вторые - обеспечивают существенно более низкие пределы обнаружения отдельных энантиомеров (до 30 мкг/мл) и большую эффективность и разрешение при разделении энантиомеров триптофана и пропранолола.
Результаты работы представлены в публикациях:
1. Д. В. Макеева, К. С. Антипова, Е. В. Соловьева, В. П. Моргачева, Е. А. Колобова, Л. А. Карцова. Полислойные покрытия на основе стабилизированных цитратом наночастиц золота и полидиаллилдиметиламмоний хлорида для электрофоретического разделения карбоновых кислот // Журнал аналитической химии. 2023, 78(3), 241-252.
2. В.П. Моргачева, Д.В. Макеева, Е.В. Соловьева, Е.А. Колобова, Л.А. Карцова. Новые подходы к формированию покрытий на основе альбумина и наночастиц золота для хирального разделения методом капиллярного электрофореза // Аналитика и контроль. 2023, 27 (№ 1).
Доклады по результатам исследований представлены на конференциях:
1. Школа-конференция молодых ученых в рамках симпозиума «Кинетика и
динамика сорбционных процессов», приуроченного к 150 -летию со дня рождения М.С. Цвета. Тема доклада: Трехслойное покрытие на основе цитрат-стабилизированных наночастиц золота и поли(диаллилдиметиламмоний хлорида) для электрофоретического определения карбоновых кислот (диплом II степени).
2. Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2023». Тема доклада: Разработка подходов к формированию покрытий стенок кварцевого капилляра на основе альбумина и наночастиц золота для хирального разделения методом капиллярного электрофореза (диплом I степени).