Благодарности 4
Список сокращений 5
1. Введение 9
2. Литературный обзор 10
2.1. Значение корневой системы растения 10
2.2. Клеточные механизмы формирования боковых корней 10
2.3. Молекулярные механизмы формирования боковых корней 11
2.4. Роль пептидного сигналинга в формировании боковых корней 13
2.4.1 Сигналинг PAMP-INDUCED SECRETED PEPTIDE-LIKE3 (PIPL3)/TARGET OF LBD SIXTEEN2 (TOLS2) 13
2.4.2. Сигналинг GOLVEN/ROOT GROWTH FACTOR/CLE-LIKE (RGF/GLV/CLEL) 13
2.4.3. Сигналинг С-TERMINALLY ENCODED PEPTIDES (CEP) 14
2.4.4. Сигналинг INFLORESCENCE DEFICIENT IN ABSCISSION (IDA) 14
2.4.5. Пептиды семейства RAPID ALKALINIZATION FACTOR (RALF) 14
2.5. Рецепция RALF 16
2.6. FERONIA - один из наиболее изученных рецепторов RALF 16
2.7. RALF34 у Arabidopsis thaliana 19
2.8. RALF34 у Cucumis sativus 20
3. Материалы и методы 20
3.1. Материалы 20
3.1.1. Растительный материал 20
3.1.2. Реагенты 21
3.2. Методы 22
3.2.1. Определение содержания пероксида водорода 22
3.2.2. Определение содержания веществ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой 22
3.2.3. Определение содержания гидропероксидов липидов 23
3.2.4. Определение содержания аскорбиновой кислоты 23
3.2.5. Выделение тотального белка из корней Cucumis sativus 24
3.2.6. Определение концентрации белка 25
3.2.7. Диск-электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия 25
3.2.8. Гидролитическое расщепление белка трипсином 26
3.2.9. Твердофазная экстракция пептидов 27
3.2.10. Подготовка проб для LC-MS/MS анализа 27
3.2.11. Nano LC-MS/MS 27
3.2.12. Биоинформатический анализ данных 29
3.2.13. Статистический анализ данных 30
4. Результаты 30
4.1. Анализ биохимических маркеров стресса в корнях Cucumis sativus 30
4.2. Выделение белка и его триптический гидролиз 32
4.3. Аннотация белков Cucumis sativus 34
4.4. Количественная оценка и функциональная аннотация 35
4.5. Функциональная аннотация 38
4.6. Влияние CsRALF34 на метаболизм корней и сигнальные пути 40
5. Обсуждение 43
5.1. Функции CsRALF34 43
5.1.1. Ингибирование роста корней и регуляция пролиферации клеток 43
5.1.2. Влияние CsRALF34 на передачу сигналов АФК и адаптацию к стрессу 44
5.1.3. Динамика клеточного метаболизма, связанная с RALF 46
5.1.4. RALF34 как модулятор фитогормональных реакций 46
5.1.5. Сверхэкспрессия RALF активирует биосинтез белка 47
6. Выводы 47
Список литературы 48
Приложение 57
Малые сигнальные пептиды, участвуя во многих процессах развития растений, являются ключевыми молекулами межклеточной коммуникации. Все малые сигнальные пептиды условно разделяют на несколько классов, один из которых представляют цистеин- богатые пептиды, к которым относится и семейство пептидов RAPID ALKALINIZATION FACTOR (RALF).
Первоначально было показано, что при добавлении пептидов в культуру клеток табака происходит резкое подщелачивание среды - пептиды семейства RALF, связываясь со своей рецепторной киназой FERONIA, ингибируют работу Н+-АТФазы 2 (AHA2), в связи с чем они и получили свое название. Спустя некоторое время конкретных представителей данного семейства пептидов начали изучать более подробно, с каждым разом обнаруживая новые роли RALF. В частности, для Arabidopsis thaliana было показано, что RALF34 действует на транскрипционный каскад, приводящий к инициации бокового корня. Чуть позже для огурца (Cucumis sativus'), представителя важного в сельскохозяйственном отношении семейства Cucurbitaceae, был идентифицирован ортолог CsRALF34. Однако роль RALF34 в развитии боковых корней Cucumis sativus до сих пор не определена, хотя предполагается сходный молекулярный механизм действия, как и у Arabidopsis thaliana. Расширение фундаментальных знаний о роли малого сигнального пептида RALF34 - основа перспективного влияния на продуктивность ценных сельскохозяйственных культур. Именно поэтому исследование роли RALF34 в регуляции внутриклеточных процессов в корнях Cucumis sativus стало целью этой работы.
Для реализации данной цели, были поставлены следующие задачи:
1. Оценить состояние корневой системы растений Cucumis sativus, сверхэкспрессирующих CsRALF34, и контрольных растений Cucumis sativus при помощи биохимических маркеров стресса;
2. Получить препарат тотального белка из корней растений Cucumis sativus, сверхэкспрессирующих CsRALF34, и контрольных растений Cucumis sativus, измерить концентрацию белка, провести его ограниченный протеолиз и хроматомасс-спектрометрический анализ полученных пептидов;
3. Выполнить анализ масс-спектрометрических данных для идентификации, проведения относительной количественной оценки и функциональной аннотации обнаруженных белков;
4. С помощью биоинформатических подходов определить внутриклеточные процессы в корнях Cucumis sativus, на которые потенциально может оказывать влияние RALF34.
Выводы
1. Оценка биохимических маркеров стресса корней растений Cucumis sativus, сверхэкспрессирующих CsRALF34, и контрольных растений Cucumis sativus продемонстрировала увеличение уровня содержания TBARS и снижение количества H2O2 в 2 раза;
2. Получен препарат тотального белка из корней экспериментальных и контрольных растений Cucumis sativus, измерена концентрация белка, проведен его ограниченный протеолиз и хромато-масс-спектрометрический анализ полученных пептидов;
3. Выполнен анализ масс-спектрометрических данных, дана количественная оценка и функциональная аннотация идентифицированных белков, которая показала наибольшее количественное изменение белков, участвующих в биосинтезе белка, везикулярном транспорте, белковом гомеостазе и модификации белков;
4. При помощи биоинформатических подходов было определено, что, вероятно, RALF34 отрицательно влияет на рост корней путем ингибирования пролифирации клеток, модулирует АФК-сигналинг и адаптацию к абиотическому стрессу, изменяет клеточный метаболизм и активирует биосинтез белка у Cucumis sativus.
