Список сокращений 4
1. Введение 5
2. Обзор литературы 6
2.1 Лептин 6
2.1.1 Строение, функции, рецепторы лептина 6
2.1.2 Сигнальные пути лептина 7
2.1.3 Фрагмент лептина 8
2.1.4 Связь эффектов лептина с гипоталамо-гипофизарно-гонадной осью 10
2.2 Гипоталамо-гипофизарно-тестикулярная ось 11
2.2.1 Гонадолиберин 11
2.2.2 Антагонист гонадолибериновых рецепторов 12
2.2.3 Другие регуляторы синтеза и секреции гонадотропинов 12
2.2.4 Гонадотропины 13
2.2.5 Половые стероидные гормоны 14
2.2.6 Стероидогенез 15
2.2.7 Механизмы обратной связи в ГГТ оси 16
2.2.8 Воздействие лептина на компоненты ГГТ оси 16
3. Цели и задачи работы 18
4. Материалы и методы 19
4.1 Схема эксперимента 19
4.2 Определение уровня половых стероидных гормонов в плазме крови и тканях семенников крыс 20
4.2.1 Метод иммуноферментного анализа для количественного определения тестостерона в плазме крови и тканях семенников крыс 21
4.2.2 Метод иммуноферментного анализа для количественного определения 17-ОН-прогестерона в тканях семенников крыс 22
4.2.3 Метод иммуноферментного анализа для количественного определения андростендиона в тканях семенников крыс 23
4.3 Метод выделения тотальной РНК из тканей гипоталамуса, гипофиза и семенников крыс 23
4.4 Обратная транскрипция 25
4.5 ПЦР в реальном времени 25
4.6 Статистический анализ 28
5. Результаты 28
5.1 Влияние интраназального введения фрагмента лептина на уровень тестостерона в крови самцов крыс в норме, на фоне введения антагониста гонадолибериновых рецепторов, а также на фоне стимуляции ХГЧ 28
5.2 Влияние интраназального введения фрагмента лептина на экспрессию генов стероидогенеза в норме, на фоне введения антагониста гонадолибериновых рецепторов, а также на фоне стимуляции ХГЧ 31
5.3 Влияние интраназального введения фрагмента лептина на уровень тестостерона и его предшественников в тканях семенников крыс в норме, на фоне введения антагониста гонадолибериновых рецепторов, а также на фоне стимуляции ХГЧ 32
5.4 Влияние интраназального введения фрагмента лептина на экспрессию генов бета- субъединиц гонадотропинов и рецептора гонадолиберина в гипофизе в норме, на фоне введения антагониста гонадолибериновых рецепторов, а также на фоне стимуляции ХГЧ 34
5.5 Влияние интраназального введения фрагмента лептина на экспрессию гена лептинового рецептора в гипоталамусе и семенниках в норме, на фоне введения антагониста гонадолибериновых рецепторов, а также на фоне стимуляции ХГЧ 35
5.6 Влияние интраназального введения фрагмента лептина на экспрессию генов, кодирующих нейропептиды GnRH, ПОМК, АНН, HHY, кисспептин и рецепторы Mc3R и Mc4R в гипоталамусе в норме, на фоне введения антагониста гонадолибериновых рецепторов, а также на фоне стимуляции ХГЧ 36
6. Обсуждение 37
7. Выводы 42
8. Заключение 43
9. Список литературы 43
В настоящее время в мире наблюдается устойчивая тенденция к снижению репродуктивного потенциала у представителей обоих полов. Значимыми факторами, способными вызывать нарушения репродуктивного здоровья, являются метаболические и эндокринные расстройства. Таким образом, актуальной задачей является поиск эффективных путей их коррекции.
Мужская репродуктивная система находится под контролем гипоталамо- гипофизарно-тестикулярной (ГГТ) оси. Нейроны гипоталамуса выделяют декапептид гонадолиберин (GnRH) - рилизинг-фактор гонадотропных гормонов аденогипофиза: лютеинизирующего (ЛГ) и фолликулостимулирующего (ФСГ), которые в свою очередь стимулируют клетки Лейдига семенников вырабатывать тестостерон - основной половой стероидный гормон у мужчин.
Одним из эндогенных регуляторов ГГТ оси является анорексигенный адипокин лептин, синтезирующийся, в основном, в адипоцитах жировой ткани. Лептин передает сигнал об энергетическом состоянии организма в гипоталамус, где его рецепторы ObRb расположены на поверхности ПОМК- и АПП/НПУ-нейронов, а также на поверхности нейронов, выделяющих кисспептин (Landry, 2013). Помимо регуляции пищевого поведения и метаболизма, меланокортиновые пептиды, как и кисспептин, стимулируют GnRH- нейроны, а агути-подобный пептид и нейропептид Y ингибируют синтез GnRH. Таким образом, лептин может опосредованно влиять на активность GnRH-продуцирующих нейронов и служит связующим звеном между метаболизмом и репродуктивной системой организма. Это подтверждают данные об отсутствии фертильности у мышей мутантных по гену лептина (ob/ob) и восстановлении фертильности при лечении лептином, а также данные о задержке полового созревания при пониженном уровне лептина в крови (Erickson, Mounzih, 1996, 1997).
Рецепторы лептина ObRb обнаружены в различных компонентах репродуктивной оси (GnRH-нейронах гипоталамуса, гонадотрофах гипофиза, стероидогенных и сперматогенных клетках семенников). В настоящее время существуют как работы, показывающее влияние лептина на гипоталамус (Nagatani, Quennell, 1998, 2009), так и работы, свидетельствующие о воздействии лептина напрямую на периферические звенья (Karlsson, Tena-Sempere, 1997, 2002).
Последние два десятилетия разрабатываются аналоги лептина - фрагменты его молекулы, повторяющие биологические эффекты лептина, однако обладающие повышенной стабильностью и проницаемостью через ГЭБ. Один из наиболее изученных фрагментов лептина (ФЛ) - фрагмент MA-[D-Leu-4]-OB3 - представляет собой N-концевой участок молекулы адипокина (Ser-Cys-Ser-D-Leu-Pro-Gln-Thr), ответственный за связывание с рецептором и его активацию. За счет замены L-лейцина на D-форму фрагмент обладает устойчивостью к протеазам и оказывает более выраженное влияние на метаболизм за счет стимуляции снижения веса, уменьшения потребления пищи и нормализации уровня глюкозы в крови. N-терминальное миристоилирование пептида увеличивает его поглощение и период полувыведения. Для данного фрагмента показан анорексигенный эффект на метаболические показатели мышей с ожирением (Rozhavskaya-Arena, Waldrop, 2000, 2010), однако его влияние на стероидогенез и на активность различных звеньев ГГТ- оси, в том числе и GnRH-нейронов гипоталамуса, пока не изучено.
В данной работе планируется изучить влияние ФЛ MA-[D-Leu-4]-OB3 на компоненты репродуктивной системы в гипоталамусе, гипофизе и семенниках самцов крыс при интраназальном способе введения. Такой способ введения позволяет ФЛ в большей степени стимулировать гипоталамический уровень ГГТ оси. Также, введение ФЛ совместно с хорионическим гонадотропином (ХГЧ) и антагонистом гонадолибериновых рецепторов цетрореликсом позволит установить, способен ли лептин регулировать негипоталамические звенья ГГТ-оси.
Нами было показано, что фрагмент лептина способен повышать уровень тестостерона в крови крыс и усиливать стимулирующий эффект ХГЧ. При этом введение антагониста GnRH рецепторов подавляет эффекты фрагмента лептина на уровень тестостерона в крови. На основе этого мы предполагаем, что фрагмент лептина действует главным образом на гипоталамическую часть тестикулярной оси.
Обработка фрагментом лептина оказывает влияние на процесс стероидогенеза в семенниках даже в присутствии антагониста GnRH, что может говорить о возможных периферических эффектах препарата.
Введение антагониста GnRH приводит к снижению экспрессии гонадолиберина и генов Npy, Pomc, Agrp, продукты которых регулируют энергетический гомеостаз организма. При этом введение фрагмента лептина частично восстанавливает экспрессию этих генов.
