Антигенные свойства нейраминидазы подтипа N9
|
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА ГРИППА А 7
1.1.1 Структурно-функциональная организация вириона вируса гриппа 7
1.1.2 Структурная организация генома вируса гриппа А 8
1.1.3 Репродукция вируса гриппа А 10
1.2 Антигенная характеристика 12
1.2.1 Структура гемагглютинина (НА) 12
1.2.2 Структура нейраминидазы (NA) 15
Строение головного домена 16
Строение стеблевого домена 20
Лекарственная устойчивость 22
1.3 Эволюция и антигенный дрейф H7N 9 25
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 31
2.1 МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 31
Аминокислотные последовательности 31
Штаммы вируса гриппа 31
Куриные эмбрионы 31
Исследуемые образцы сывороток крови волонтеров 31
2.2 Методы исследования 32
2.2.1 Эволюционный анализ последовательностей аминокислот NA 32
2.2.2 Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах 32
2.2.3 Концентрирование и очистка вируса в ступенчатом градиенте сахарозы 32
2.2.4 Обработка сывороток крови 33
2.2.5 Постановка реакции торможения гемагглютинирующей активности (РТГА) 33
2.2.6 Изучение нейраминидазной активности вирусов гриппа 34
2.2.7 Статистическая обработка данных 34
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 36
3.1 Филогенетический анализ нейраминидазы вирусов H7N9, выделенных в период 2013-2017г 36
3.2 Оценка ферментативной активности NA H7N9, выделенных в 2013 и 2017 гг. 38
3.3 Изучение иммуногенности ЖГВ на основе вирусов А/Н7N9, выделенных в 2013 и 2017 гг 39
3.4 Изучение защитной эффективности моноклональных антител (мАТ) к N9-13 против инфекции вирусом A/H7N9-17 40
ВЫВОДЫ 42
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 43
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА ГРИППА А 7
1.1.1 Структурно-функциональная организация вириона вируса гриппа 7
1.1.2 Структурная организация генома вируса гриппа А 8
1.1.3 Репродукция вируса гриппа А 10
1.2 Антигенная характеристика 12
1.2.1 Структура гемагглютинина (НА) 12
1.2.2 Структура нейраминидазы (NA) 15
Строение головного домена 16
Строение стеблевого домена 20
Лекарственная устойчивость 22
1.3 Эволюция и антигенный дрейф H7N 9 25
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 31
2.1 МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 31
Аминокислотные последовательности 31
Штаммы вируса гриппа 31
Куриные эмбрионы 31
Исследуемые образцы сывороток крови волонтеров 31
2.2 Методы исследования 32
2.2.1 Эволюционный анализ последовательностей аминокислот NA 32
2.2.2 Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах 32
2.2.3 Концентрирование и очистка вируса в ступенчатом градиенте сахарозы 32
2.2.4 Обработка сывороток крови 33
2.2.5 Постановка реакции торможения гемагглютинирующей активности (РТГА) 33
2.2.6 Изучение нейраминидазной активности вирусов гриппа 34
2.2.7 Статистическая обработка данных 34
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 36
3.1 Филогенетический анализ нейраминидазы вирусов H7N9, выделенных в период 2013-2017г 36
3.2 Оценка ферментативной активности NA H7N9, выделенных в 2013 и 2017 гг. 38
3.3 Изучение иммуногенности ЖГВ на основе вирусов А/Н7N9, выделенных в 2013 и 2017 гг 39
3.4 Изучение защитной эффективности моноклональных антител (мАТ) к N9-13 против инфекции вирусом A/H7N9-17 40
ВЫВОДЫ 42
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 43
Грипп является социально значимой инфекцией, ежегодно наносящей значительный ущерб здоровью населения и экономике страны. Возбудитель гриппа обладает высокой изменчивостью, периодически появляются пандемически опасные вирусы ранее не циркулировавших среди людей подтипов. На текущий момент в качестве пандемической угрозы всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) рассматриваются высоко- и низкопатогенные штаммы вируса гриппа птиц подтипов H5, H7 и H9, получившие широкое территориальное распространение и ассоциированные со спорадическими инфекциями у людей.
В Китае в марте 2013 года у пациентов с лихорадкой и тяжелым поражением нижних дыхательный путей был идентифицирован реассортантный низкопатогенный вирус птичьего гриппа H7N9. Этот вирус неоднократно вызывал инфицирование людей, приводящее к осложнениям, включающих полиорганную недостаточность и острый респираторный синдром. Так, в период с марта 2013 г. по июль 2017 года в Китае было зарегистрировано более 1550 лабораторно подтвержденных случаев заражения человека вирусом птичьего гриппа A H7N9, при этом летальность составила примерно 39% [61]. В двух случаях инфекция вирусом гриппа птиц A(H7N9) была диагностирована на территории Канады, у путешественников, возвратившихся из Китая в январе 2015 года.
С момента появления низкопатогенного вируса птичьего гриппа А H7N9 было зарегистрировано пять эпидемических волн [62]. При этом, пятая волна характеризуется более широким ареалом распространения, а также значительным увеличением случаев заболеваний среди людей. Что еще более важно, после эволюционных изменений в пятую волну, в конце 2016 года, появились высокопатогенные вирусы птичьего гриппа H7N9 [70].
Предположительно источником заражения послужила инфицированная домашняя птица и контаминированная окружающая среда, прежде всего птичьи рынки. Не исключается и передача вируса от человека к человеку по крайней мере в 17 выявленных кластерах, состоявших из 2-3 членов семьи. На сегодняшний день все штаммы вирусов H7N9 по- прежнему ограничены птичьими резервуарами и не способны к устойчивой трансмиссии среди человеческой популяции.
Однако, недооценивать пандемический потенциал вирусов гриппа H7N9 и совсем исключать возможность передачи вируса от человека к человеку нельзя. Так, было продемонстрировано, что отдельные человеческие изоляты LPIAV H7N9 способны к передаче воздушно-капельным путем у хорьков [70]. Также было показано, что новый новый HPIAV H7N9, в отличие от LP H7N9, способен эффективно реплицироваться в утках, приводя их к летальному исходу и способствуя тем самым распространению вируса. Кроме того, у высоко- и низкопатогенных вирусов H7N9 были обнаружены мутации, связанные с приобретением лекарственной устойчивости к основным противовирусным препаратам, и ряд аминокислотных замен, увеличивающих тропизм к рецепторам человека.
В случае возникновения пандемической ситуации возможности химиотерапевтических средств могут оказаться ограниченными необходимостью массового многократного применения, а также устойчивостью к ним пандемических штаммов. Наиболее эффективный способ борьбы с гриппом - вакцинопрофилактика. В связи с чем, актуальным научнопрактическим направлением является создание международных и государственных коллекций вакцинных штаммов вируса гриппа потенциально пандемических подтипов, прошедших все надлежащие стадии доклинических/клинических испытаний и продемонстрировавших высокую иммуногенность. Созданный резерв позволит в случае необходимости в кратчайшие сроки начать производство вакцинных препаратов и масштабную иммунизацию населения.
Изменения патогенности и вирулентности вирусов H7N9 были связаны с потенциальными мутациями в антигенах структурах: вирусных гликопротеинов гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA). Большая часть исследований была направлена на рецепторы HA, тогда как работ, посвященных, молекулярным изменениям нейраминидазы было гораздо меньше. Тем не менее, было продемонстрировано, что некоторые аминокислотные замены в NA предшествовали изменениям в НА и способствовали увеличению патогенности и вирулентности H7N9.
Есть свидетельства о том, что что частота нуклеотидных замен штаммов H7N9 за период 2018-2019 гг. увеличилась в несколько раз, по сравнению с изолятами пятой волны, что свидетельствует о быстрой мутации высокопатогенного вируса гриппа. Это означает, вирусы H7N9 продолжают эволюционировать как генетически, так и антигенно. В связи с этим, одной из приоритетных задач ВОЗ является подготовка к пандемии гриппа A(H7N9), которая включает в себя создание коллекций вакцинных штаммов с целью скорейшего начала производства вакцины и иммунизации населения в случае пандемической угрозы A(H7N9) и оценку степени восприимчивости населения к потенциально пандемическому штамму вируса гриппа A(H7N9). Первый этап подготовки подразумевает всестороннюю, полную характеристику иммуногенности и защитной эффективности вакцинных препаратов потенциально пандемического подтипа, в том числе с применением методов выявления гуморального иммунного ответа к NA вируса гриппа. Второй этап включает исследование гетеросубтипического противогриппозного иммунитета, опосредованного целым рядом факторов: антигемагглютинирующими и антинейраминидазными антителами, Т-клетками памяти и т.д.
Целью данной работы было изучение и сравнений антигенных свойств NA вирусов A/H7N9, выделенных до и после 2016 года.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1) Проведение молекулярно-генетический анализ вирусов H7N9, выделенных за период 2013-2017 гг.
2) Проведение ферментативный анализ и оценить активность NA в вирусах H7N9 2013 и 2017 года.
3) Изучение иммуногенности ЖГВ на основе вирусов A/H7N9, выделенных в 2013 и 2017 гг.
4) Изучения защитной эффективности моноклональных антител к N9-13 против инфекции вирусом A/H7N9-17.
В Китае в марте 2013 года у пациентов с лихорадкой и тяжелым поражением нижних дыхательный путей был идентифицирован реассортантный низкопатогенный вирус птичьего гриппа H7N9. Этот вирус неоднократно вызывал инфицирование людей, приводящее к осложнениям, включающих полиорганную недостаточность и острый респираторный синдром. Так, в период с марта 2013 г. по июль 2017 года в Китае было зарегистрировано более 1550 лабораторно подтвержденных случаев заражения человека вирусом птичьего гриппа A H7N9, при этом летальность составила примерно 39% [61]. В двух случаях инфекция вирусом гриппа птиц A(H7N9) была диагностирована на территории Канады, у путешественников, возвратившихся из Китая в январе 2015 года.
С момента появления низкопатогенного вируса птичьего гриппа А H7N9 было зарегистрировано пять эпидемических волн [62]. При этом, пятая волна характеризуется более широким ареалом распространения, а также значительным увеличением случаев заболеваний среди людей. Что еще более важно, после эволюционных изменений в пятую волну, в конце 2016 года, появились высокопатогенные вирусы птичьего гриппа H7N9 [70].
Предположительно источником заражения послужила инфицированная домашняя птица и контаминированная окружающая среда, прежде всего птичьи рынки. Не исключается и передача вируса от человека к человеку по крайней мере в 17 выявленных кластерах, состоявших из 2-3 членов семьи. На сегодняшний день все штаммы вирусов H7N9 по- прежнему ограничены птичьими резервуарами и не способны к устойчивой трансмиссии среди человеческой популяции.
Однако, недооценивать пандемический потенциал вирусов гриппа H7N9 и совсем исключать возможность передачи вируса от человека к человеку нельзя. Так, было продемонстрировано, что отдельные человеческие изоляты LPIAV H7N9 способны к передаче воздушно-капельным путем у хорьков [70]. Также было показано, что новый новый HPIAV H7N9, в отличие от LP H7N9, способен эффективно реплицироваться в утках, приводя их к летальному исходу и способствуя тем самым распространению вируса. Кроме того, у высоко- и низкопатогенных вирусов H7N9 были обнаружены мутации, связанные с приобретением лекарственной устойчивости к основным противовирусным препаратам, и ряд аминокислотных замен, увеличивающих тропизм к рецепторам человека.
В случае возникновения пандемической ситуации возможности химиотерапевтических средств могут оказаться ограниченными необходимостью массового многократного применения, а также устойчивостью к ним пандемических штаммов. Наиболее эффективный способ борьбы с гриппом - вакцинопрофилактика. В связи с чем, актуальным научнопрактическим направлением является создание международных и государственных коллекций вакцинных штаммов вируса гриппа потенциально пандемических подтипов, прошедших все надлежащие стадии доклинических/клинических испытаний и продемонстрировавших высокую иммуногенность. Созданный резерв позволит в случае необходимости в кратчайшие сроки начать производство вакцинных препаратов и масштабную иммунизацию населения.
Изменения патогенности и вирулентности вирусов H7N9 были связаны с потенциальными мутациями в антигенах структурах: вирусных гликопротеинов гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA). Большая часть исследований была направлена на рецепторы HA, тогда как работ, посвященных, молекулярным изменениям нейраминидазы было гораздо меньше. Тем не менее, было продемонстрировано, что некоторые аминокислотные замены в NA предшествовали изменениям в НА и способствовали увеличению патогенности и вирулентности H7N9.
Есть свидетельства о том, что что частота нуклеотидных замен штаммов H7N9 за период 2018-2019 гг. увеличилась в несколько раз, по сравнению с изолятами пятой волны, что свидетельствует о быстрой мутации высокопатогенного вируса гриппа. Это означает, вирусы H7N9 продолжают эволюционировать как генетически, так и антигенно. В связи с этим, одной из приоритетных задач ВОЗ является подготовка к пандемии гриппа A(H7N9), которая включает в себя создание коллекций вакцинных штаммов с целью скорейшего начала производства вакцины и иммунизации населения в случае пандемической угрозы A(H7N9) и оценку степени восприимчивости населения к потенциально пандемическому штамму вируса гриппа A(H7N9). Первый этап подготовки подразумевает всестороннюю, полную характеристику иммуногенности и защитной эффективности вакцинных препаратов потенциально пандемического подтипа, в том числе с применением методов выявления гуморального иммунного ответа к NA вируса гриппа. Второй этап включает исследование гетеросубтипического противогриппозного иммунитета, опосредованного целым рядом факторов: антигемагглютинирующими и антинейраминидазными антителами, Т-клетками памяти и т.д.
Целью данной работы было изучение и сравнений антигенных свойств NA вирусов A/H7N9, выделенных до и после 2016 года.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1) Проведение молекулярно-генетический анализ вирусов H7N9, выделенных за период 2013-2017 гг.
2) Проведение ферментативный анализ и оценить активность NA в вирусах H7N9 2013 и 2017 года.
3) Изучение иммуногенности ЖГВ на основе вирусов A/H7N9, выделенных в 2013 и 2017 гг.
4) Изучения защитной эффективности моноклональных антител к N9-13 против инфекции вирусом A/H7N9-17.
1. Молекулярно-генетический анализ последовательностей нейраминидазы указывает на изменения в антигенной структуре нейраминидазы вирусов H7N9 за период с 2013 по 2017 гг. Филогенетическое древо демонстрирует, что высокопатогенные вирусы 2017 года эволюционировали от низкопатогенных штаммов, путем накопления мутаций в NA.
2. Анализ энзиматической активности нейраминидазы демонстрирует различие в активности NA вирусов, выделенных в разные годы. Так, NA вируса A/Hong Kong/125/2017(H7N9) продемонстрировала более высокую ферментативную активность с высокомолекулярным субстратом фетуином по сравнению с NA H7N9-13.
3. Иммунизация ЖГВ на основе A/Anhui/1/2013(H7N9) и A/Hong Kong/125/2017(H7N9) не вызывают образование перекрестных реактивных антител. Что также указывает на различия в антигенной структуре вирусов 2013 и 2017гг.
4. При пассивной иммунизации моноклональными антителами к A/Anhui/1/2013(H7N9), наблюдалась выработка антител как к вирусу A/Anhui/1/2013(H7N9), так и к A/Hong Kong/125/2017(H7N9). Также пассивная иммунизация способствовала снижению титра вируса в легких. Таким образом, моноклональные антитела к вирусу 2013 года частично защищают организм от вирусов, выделенных в 2017 году, проявляя слабое терапевтическое действие.
2. Анализ энзиматической активности нейраминидазы демонстрирует различие в активности NA вирусов, выделенных в разные годы. Так, NA вируса A/Hong Kong/125/2017(H7N9) продемонстрировала более высокую ферментативную активность с высокомолекулярным субстратом фетуином по сравнению с NA H7N9-13.
3. Иммунизация ЖГВ на основе A/Anhui/1/2013(H7N9) и A/Hong Kong/125/2017(H7N9) не вызывают образование перекрестных реактивных антител. Что также указывает на различия в антигенной структуре вирусов 2013 и 2017гг.
4. При пассивной иммунизации моноклональными антителами к A/Anhui/1/2013(H7N9), наблюдалась выработка антител как к вирусу A/Anhui/1/2013(H7N9), так и к A/Hong Kong/125/2017(H7N9). Также пассивная иммунизация способствовала снижению титра вируса в легких. Таким образом, моноклональные антитела к вирусу 2013 года частично защищают организм от вирусов, выделенных в 2017 году, проявляя слабое терапевтическое действие.
Подобные работы
- Антигенные свойства нейраминидазы подтипа N9
Дипломные работы, ВКР, биология. Язык работы: Русский. Цена: 4750 р. Год сдачи: 2023