Трансфекция мышц комплексами ДНК с катионными пептидами и анионным пептидным покрытием
|
Список сокращений 4
Введение 5
Обзор литературы 8
1. Успехи генной терапии и основные трудности 8
2. Вирусные векторы 10
3. Невирусные векторы 11
4. Доставка нуклеиновых кислот в мышечную ткань 15
4.1. Вирусная доставка 17
4.2. Невирусная доставка 19
5. Генная терапия наследственных заболеваний, связанных с мышцами 22
5.1. Мышечная дистрофия Дюшенна и Беккера 22
5.2. Конечностно-поясные мышечные дистрофии 27
5.3. Миотоническая дистрофия 28
Материал и методы 29
Материал 29
Методы 30
1. Тест на вытеснение красителя бромистого этидия 30
2. Измерение дзета-потенциалов и размеров комплексов ДНК/носитель/модуль 30
3. Тест на токсичность комплексов ДНК/носитель/модуль после трансфекции культуры клеток C2C12 31
4. Трансфекция in vitro клеток C2C12 комплексами ДНК/носитель/модуль 31
5. Доставка плазмидной ДНК с геном GFP бедренную мышцу мышей mdx 34
6. Окрашивание срезов мышц гематоксилин-эозином 35
7. Изучение трансфецируемости дифференцированных и недифференцированных клеток C2C12 комплексами ДНК/Turbofect 35
8. Статистическая обработка 36
Результаты 37
1. Влияние соотношения заряда анионных носителей на образование комплексов 37
2. Дзета-потенциалы и размеры комплексов ДНК/носитель/модуль 40
3. Выживаемость клеток линии C2C12 после трансфекции комплексами ДНК/носитель/модуль 41
4. Трансфецирующая способность комплексов ДНК/носитель/модуль на клетках C2C12 в экспериментах in vitro 42
5. Трансфецирующая способность комплексов ДНК/носитель/модуль на мышцах мышей линии mdx в эксперименте in vivo 44
Обсуждение 47
Выводы 51
Список литературы 52
Благодарности 59
Введение 5
Обзор литературы 8
1. Успехи генной терапии и основные трудности 8
2. Вирусные векторы 10
3. Невирусные векторы 11
4. Доставка нуклеиновых кислот в мышечную ткань 15
4.1. Вирусная доставка 17
4.2. Невирусная доставка 19
5. Генная терапия наследственных заболеваний, связанных с мышцами 22
5.1. Мышечная дистрофия Дюшенна и Беккера 22
5.2. Конечностно-поясные мышечные дистрофии 27
5.3. Миотоническая дистрофия 28
Материал и методы 29
Материал 29
Методы 30
1. Тест на вытеснение красителя бромистого этидия 30
2. Измерение дзета-потенциалов и размеров комплексов ДНК/носитель/модуль 30
3. Тест на токсичность комплексов ДНК/носитель/модуль после трансфекции культуры клеток C2C12 31
4. Трансфекция in vitro клеток C2C12 комплексами ДНК/носитель/модуль 31
5. Доставка плазмидной ДНК с геном GFP бедренную мышцу мышей mdx 34
6. Окрашивание срезов мышц гематоксилин-эозином 35
7. Изучение трансфецируемости дифференцированных и недифференцированных клеток C2C12 комплексами ДНК/Turbofect 35
8. Статистическая обработка 36
Результаты 37
1. Влияние соотношения заряда анионных носителей на образование комплексов 37
2. Дзета-потенциалы и размеры комплексов ДНК/носитель/модуль 40
3. Выживаемость клеток линии C2C12 после трансфекции комплексами ДНК/носитель/модуль 41
4. Трансфецирующая способность комплексов ДНК/носитель/модуль на клетках C2C12 в экспериментах in vitro 42
5. Трансфецирующая способность комплексов ДНК/носитель/модуль на мышцах мышей линии mdx в эксперименте in vivo 44
Обсуждение 47
Выводы 51
Список литературы 52
Благодарности 59
Доставка нуклеиновых кислот в мышечные клетки является актуальной проблемой современной науки. Мышечная трансфекция считается одной из наиболее трудноосуществимых сразу по нескольким причинам. Во-первых, на мышечных клетках существует не так много рецепторов, с которыми могут связываться наночастицы, что, в свою очередь, снижает эффективность и специфичность доставки. Во-вторых, скелетные мышцы представлены синцитиальными мышечными волокнами, утратившими способность к митотическому делению, что приводит к снижению эффективности доставки конструкций, не несущих сигналы ядерной локализации (Zabner et al., 1995).
Трансфекция мышц имеет множество применений. В первую очередь следует упомянуть генную терапию наследственных заболеваний, связанных с нарушением работы мышц. К таким заболеваниям относят, например, мышечную дистрофию Дюшенна. На данный момент существует большое число подходов к генной терапии миодистрофии Дюшенна («пропуск экзона», вырезание экзонов с помощью системы CRISPR/Cas9 и т.д.), однако ограничивающим фактором до сих пор является отсутствие безопасного и высокоэффективного вектора доставки (Min et al., 2019). Исследование и разработка наиболее эффективных способов доставки нуклеиновых кислот в мышечные клетки позволят повысить качество генной терапии наследственных заболеваний мышц. Также мышечная ткань используется для доставки в нее ДНК- и мРНК-вакцин для продуцирования антигенов и последующей иммунизации организма.
Несмотря на то, что в настоящее время в большинстве исследований по генной терапии используются вирусные векторы (ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы и др.), они имеют ряд недостатков по сравнению с невирусными носителями. Одним из главных преимуществ невирусных носителей является «неограниченная» емкость загрузки упаковываемой нуклеиновой кислоты, тогда как вирусные носители имеют ограничение размера доставляемой ДНК до 30 т.п.н. (Lukashev, Zamyatnin, 2016). Вследствие этого с помощью вирусных носителей нельзя доставлять крупные гены, такие как ген дистрофина (Shevchenko, 2012). Также необходимо учитывать тот факт, что, несмотря на адаптированность вирусных векторов для доставки генетического материала, они способны вызывать иммунные реакции.
Существует несколько типов невирусных носителей для доставки ДНК: липосомы, полимерные соединения, пептидные носители и др. Для связывания ДНК используются, в основном, катионные соединения. Они электростатически связываются с отрицательно заряженными фосфатными группами нуклеиновой кислоты, образуя стабильный комплекс. Чаще всего в качестве катионных пептидных носителей используются аргинин- и лизин- богатые олигопептиды, имеющие избыточный положительный заряд. Дополнительно к олигопептидам могут быть присоединены лиганды к определенным рецепторам для направленной и более эффективной доставки в соответствующий тип ткани (Kang et al., 2019).
Одной из серьезных проблем большинства катионных невирусных носителей является крайне низкая эффективность трансфекции в присутствии компонентов плазмы крови и межклеточной жидкости и, как следствие, низкая эффективность трансфекции in vivo. Происходит это вследствие агрегации положительно заряженных комплексов с отрицательно заряженными белками сыворотки и компонентами плазмы крови. Для решения данной проблемы существует несколько подходов. Например, добавление к носителям полиэтиленгликоля (ПЭГ) повышает стерическую устойчивость комплексов. В случае пептидных носителей катионные комплексы могут быть дополнительно покрыты слоем анионных пептидов для электростатического отталкивания комплексов от белков сыворотки (Shmueli et al., 2010).
Ранее в исследованиях, проведенных в нашей лаборатории, была продемонстрирована эффективность комплексов ДНК с катионными и анионными пептидами в экспериментах по трансфекции in vitro на клеточной линии миобластов мыши C2C12 и in vivo на линии мышей с мутантным геном дистрофина (mdx). Однако вследствие большого объема упаковки, требуемого для образования комплексов с адекватными физико-химическими параметрами, не удается доставлять большое количество ДНК в мышечные клетки, так как объем трансфецирующей смеси ограничен размером мышцы. Малое количество доставляемой ДНК напрямую связано с низкой эффективностью трансфекции. Одним из направлений данной работы является уменьшение объема упаковки комплексов без потери эффективности трансфекции.
Целью работы является изучение катионных и анионных пептидных носителей в качестве транфекционного агента мышечной ткани животных.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить защитные свойства комплексов, сформированных при различных зарядовых соотношениях пептидных носителей и плазмидной ДНК, а также их физико-химические свойства.
2. Изучить токсические свойства комплексов пептидных носителей с плазмидной ДНК на культуре клеток миобластов мыши С2С12.
3. Изучить трансфекционные свойства комплексов пептидных носителей с плазмидной ДНК на культуре клеток миобластов мыши C2C12.
4. Оценить эффективность доставки репортерных генов in vivo после внутримышечного введения комплексов мышам линии mdx.
Трансфекция мышц имеет множество применений. В первую очередь следует упомянуть генную терапию наследственных заболеваний, связанных с нарушением работы мышц. К таким заболеваниям относят, например, мышечную дистрофию Дюшенна. На данный момент существует большое число подходов к генной терапии миодистрофии Дюшенна («пропуск экзона», вырезание экзонов с помощью системы CRISPR/Cas9 и т.д.), однако ограничивающим фактором до сих пор является отсутствие безопасного и высокоэффективного вектора доставки (Min et al., 2019). Исследование и разработка наиболее эффективных способов доставки нуклеиновых кислот в мышечные клетки позволят повысить качество генной терапии наследственных заболеваний мышц. Также мышечная ткань используется для доставки в нее ДНК- и мРНК-вакцин для продуцирования антигенов и последующей иммунизации организма.
Несмотря на то, что в настоящее время в большинстве исследований по генной терапии используются вирусные векторы (ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы и др.), они имеют ряд недостатков по сравнению с невирусными носителями. Одним из главных преимуществ невирусных носителей является «неограниченная» емкость загрузки упаковываемой нуклеиновой кислоты, тогда как вирусные носители имеют ограничение размера доставляемой ДНК до 30 т.п.н. (Lukashev, Zamyatnin, 2016). Вследствие этого с помощью вирусных носителей нельзя доставлять крупные гены, такие как ген дистрофина (Shevchenko, 2012). Также необходимо учитывать тот факт, что, несмотря на адаптированность вирусных векторов для доставки генетического материала, они способны вызывать иммунные реакции.
Существует несколько типов невирусных носителей для доставки ДНК: липосомы, полимерные соединения, пептидные носители и др. Для связывания ДНК используются, в основном, катионные соединения. Они электростатически связываются с отрицательно заряженными фосфатными группами нуклеиновой кислоты, образуя стабильный комплекс. Чаще всего в качестве катионных пептидных носителей используются аргинин- и лизин- богатые олигопептиды, имеющие избыточный положительный заряд. Дополнительно к олигопептидам могут быть присоединены лиганды к определенным рецепторам для направленной и более эффективной доставки в соответствующий тип ткани (Kang et al., 2019).
Одной из серьезных проблем большинства катионных невирусных носителей является крайне низкая эффективность трансфекции в присутствии компонентов плазмы крови и межклеточной жидкости и, как следствие, низкая эффективность трансфекции in vivo. Происходит это вследствие агрегации положительно заряженных комплексов с отрицательно заряженными белками сыворотки и компонентами плазмы крови. Для решения данной проблемы существует несколько подходов. Например, добавление к носителям полиэтиленгликоля (ПЭГ) повышает стерическую устойчивость комплексов. В случае пептидных носителей катионные комплексы могут быть дополнительно покрыты слоем анионных пептидов для электростатического отталкивания комплексов от белков сыворотки (Shmueli et al., 2010).
Ранее в исследованиях, проведенных в нашей лаборатории, была продемонстрирована эффективность комплексов ДНК с катионными и анионными пептидами в экспериментах по трансфекции in vitro на клеточной линии миобластов мыши C2C12 и in vivo на линии мышей с мутантным геном дистрофина (mdx). Однако вследствие большого объема упаковки, требуемого для образования комплексов с адекватными физико-химическими параметрами, не удается доставлять большое количество ДНК в мышечные клетки, так как объем трансфецирующей смеси ограничен размером мышцы. Малое количество доставляемой ДНК напрямую связано с низкой эффективностью трансфекции. Одним из направлений данной работы является уменьшение объема упаковки комплексов без потери эффективности трансфекции.
Целью работы является изучение катионных и анионных пептидных носителей в качестве транфекционного агента мышечной ткани животных.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить защитные свойства комплексов, сформированных при различных зарядовых соотношениях пептидных носителей и плазмидной ДНК, а также их физико-химические свойства.
2. Изучить токсические свойства комплексов пептидных носителей с плазмидной ДНК на культуре клеток миобластов мыши С2С12.
3. Изучить трансфекционные свойства комплексов пептидных носителей с плазмидной ДНК на культуре клеток миобластов мыши C2C12.
4. Оценить эффективность доставки репортерных генов in vivo после внутримышечного введения комплексов мышам линии mdx.
Выводы
1. Все типы исследуемых пептидных носителей образуют стабильные комплексы с ДНК.
2. Причиной низкой эффективности трансфекции некоторых комплексов является их крупный размер и слабо положительный дзета-потенциал.
3. Комплексы, образуемые всеми пептидными носителями, не токсичны для культуры клеток C2C12.
4. Уменьшение объема упаковки комплексов в 5 раз в большинстве случаев не снижает эффективность трансфекции культуры клеток C2C12, что позволяет использовать данные типы комплексов в экспериментах in vivo.
5. Увеличение дозы ДНК, вводимой мышам линии mdx внутримышечно, за счет уменьшение объема упаковки изученных комплексов приводит к повышению эффективности трансфекции.
1. Все типы исследуемых пептидных носителей образуют стабильные комплексы с ДНК.
2. Причиной низкой эффективности трансфекции некоторых комплексов является их крупный размер и слабо положительный дзета-потенциал.
3. Комплексы, образуемые всеми пептидными носителями, не токсичны для культуры клеток C2C12.
4. Уменьшение объема упаковки комплексов в 5 раз в большинстве случаев не снижает эффективность трансфекции культуры клеток C2C12, что позволяет использовать данные типы комплексов в экспериментах in vivo.
5. Увеличение дозы ДНК, вводимой мышам линии mdx внутримышечно, за счет уменьшение объема упаковки изученных комплексов приводит к повышению эффективности трансфекции.
Подобные работы
- Трансфекция мышц комплексами ДНК с катионными пептидами и анионным пептидным покрытием
Бакалаврская работа, биология. Язык работы: Русский. Цена: 4360 р. Год сдачи: 2023 - Трансфекция мышц комплексами ДНК с катионными пептидами и анионным пептидным покрытием
Дипломные работы, ВКР, биология. Язык работы: Русский. Цена: 4600 р. Год сдачи: 2023