Изучение взаимосвязи активного деметилирования и фрагментации ДНК в клетках сперматогенного ряда при нарушениях сперматогенеза у человека

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Сперматогенез человека 7
1.2. Нарушения сперматогенеза, приводящие к бесплодию 11
1.3. Метилирование/деметилирование ДНК как основной способ репрограммирования генома 13
1.4. Влияние внешней среды на активность и целостность генома половых клеток 19
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 24
2.1. Материал 24
2.2. Методы 24
2.2.1. Методика приготовления препаратов из биоптата тканей семенника 24
2.2.2. Обработка препаратов биоптатов семенников методом TUNEL 24
2.2.3. Флуоресцентная гибридизация in situ на препаратах из биоптатов семенников 25
2.2.4. Иммуноцитохимическое окрашивание препаратов из биоптатов семенников с помощью антител к 5hmC 26
2.2.5. Методика приготовления препаратов сперматозоидов из эякулята человека 26
2.2.6. Обработка препаратов эякулята методом TUNEL 27
2.2.7. Иммуноцитохимическое окрашивание препаратов из эякулятов с помощью антител к 5hmC 27
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 29
3.1. Анализ взаимосвязи фрагментации и гидрокисметилирования ДНК в ядрах клеток сперматогенного ряда человека 29
3.2. Анализ взаимосвязи фрагментации и гидроксиметилирования ДНК в эякулированных сперматозоидах 34
3.3. Сопоставление доли сперматозоидов, содержащих и фрагментированную ДНК, и 5hmC, и параметров спермограммы 38
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 40
ВЫВОДЫ 41
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 42
Купить

Бесплодие в настоящее время является большой социальной проблемой. В половине случаев бесплодным в паре является мужчина. Нарушение сперматогенеза у мужчины может иметь генетическую природу. Однако во многих случаях нарушения не затрагивают последовательность ДНК.
Завершающие этапы сперматогенеза являются крайне чувствительными к действию факторов внешней среды. Во время созревания сперматозоида удаляется большая часть цитоплазмы, что делает клетку чувствительной к действию факторов внешней среды, а также происходит сверхконденсация ДНК, что делает геном сперматозоида не активным, и вся последующая функциональная активность сперматозоидов будет зависеть от запасенных протеинов и РНК. Сперматозоид с поврежденной ДНК может быть способен к оплодотворению, однако образовавшийся эмбрион будет иметь сниженный потенциал к дроблению и последующему развитию. Факторы внешней среды могут влиять как на структуру ДНК, так и на ее эпигенетические модификации.
Эпигенетика изучает изменения экспрессии генов, которые происходят без изменений в структуре ДНК. Основной эпигенетической модификацией является метилирование ДНК. Метилирование ДНК заключается в присоединение метильной группы к цитозину в CpG-динуклеотидах с образованием 5-метилцитозина (5mC). Метилированные CpG-динуклеотиды являются химически стабильными, однако рисунок метилирования может меняться в течение жизни индивидуума (Richards, 2018).
Обратный процесс - деметилирование ДНК - на некоторых этапах развития организма является запрограммированным процессом. В частности, высокий уровень кислородсодержащих производных 5mC в сперматогониях типа А является именно генетически запрограммированным процессом, являющимся одним из этапов репрограммирования генома половых клеток. Однако активное деметилирование может происходить и спонтанно в ответ на влияние факторов внешней среды, приводя к нарушениям в работе генома. Одной из причин спонтанного гидроксиметилирования является избыточное количество активных форм кислорода (АФК) при оксидативном стрессе.
Оксидативный стресс также приводит к появлению разрывов в ДНК и, как следствие, к ее фрагментации. Наиболее уязвимыми к окислительному воздействию АФК являются сперматозоиды. Повреждения ДНК сперматозоидов, как и потеря метильных групп, могут приводить к бесплодию или нарушениям в развитии зародыша вплоть до его летального исхода. Именно поэтому изучение данного вопроса является крайне важным в настоящее время.
Возможно, что в сперматозоидах процесс гидроксиметилирования и фрагментации ДНК являются спонтанными и опосредованы действием АФК. Напротив, в клетках сперматогенного ряда - сперматогониях и сперматидах, оба процесса являются элементами нормальных процессов, происходящих в семенниках: гидроксиметилирование происходит в рамках запрограммированного активного деметилирования, а ДНК фрагментируется при апоптозе клеток.
Таким образом, целью настоящей работы является анализ взаимосвязи процессов гидроксиметилирования и фрагментации ДНК в клетках сперматогенного ряда человека при нарушениях фертильности.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
• Оптимизировать метод приготовления препаратов из биоптатов семенников для выявления разрывов в ДНК методом TUNEL
• Оценить долю ядер, содержащих 5-гидроксиметилцитозин и фрагментированную ДНК, в сперматогониях из биоптатов семенников пациентов с азооспермией
• Оценить долю сперматид, содержащих 5-гидроксиметилцитозин и фрагментированную ДНК, в биоптатах семенников пациентов с азооспермией
• Выявить долю сперматозоидов в эякуляте, содержащих одновременно фрагментированную ДНК и 5-гидроксиметилцитозин, у пациентов с нарушениями фертильности
• Проанализировать взаимосвязь между параметрами спермограммы и долей клеток, в которых одновременно выявлена фрагментированная ДНК и 5- гидроксиметилцитозин.
Купить