Модулирование ингибиторами гистоновых деацетилаз активности транскрипционных факторов FoxO

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
ОНКОГЕННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ 8
Онкогенная трансформация как метод получения модельных систем 8
Онкоген E1A аденовируса человека 9
Цитоплазматический онкоген ras 10
Гистоновая упаковка ДНК 11
Ацетилирование и деацетилирование гистонов 12
Ингибиторы гистоновых деацетилаз (HDACi) 13
ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ FOXO 14
Семейство белков Forkhead 14
Функции белков FoxO 15
Гены-мишени транскрипционных факторов FoxO 16
Регуляция экспрессии и активации FoxO 17
Посттрансляционные модификации FoxO 18
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 19
Клеточные линии и культивирование клеток 19
Выделение клеточных экстрактов 19
Фракционирование клеток 19
Диск-электрофорез белков по Laemmli 20
Иммуноблоттинг 20
Иммунофлуоресценция 21
Детектирование АФК 21
Выделение РНК 22
Обратная транскрипция 22
ОТ-ПЦР 22
Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле 23
«Быстрая» трансфекция эукариотических клеток 23
Люциферазный анализ 24
Статистическая обработка полученных результатов 24
РЕЗУЛЬТАТЫ 25
Длительное действие бутирата натрия приводит к ингибированию экспрессии FoxO и накоплению АФК в ElA+Ras-трансформированных клетках 25
Бутират натрия не ингибирует экспрессию FoxO и не приводит к накоплению АФК в клетках с отрицательным статусом экспрессии E1A 26
Регуляция экспрессии FoxO ингибиторами HDAC имеет преимущественно посттранскрипционный характер 29
Под действием бутирата натрия в ElA+Ras-трансформированных клетках происходит перемещение FoxO в ядро 31
Обработка клеток ингибиторами гистоновых деацетилаз повышает трансактивирующую способность FoxO 33
Ингибиторы деацетилаз гистонов вызывают дополнительное накопление киназы PKB/Akt в ElA+Ras-трансформированных клетках 33
При длительном действии бутирата натрия происходит активация экспрессии генов- утилизаторов АФК 34
ОБСУЖДЕНИЕ 35
ВЫВОДЫ 37
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 38
БЛАГОДАРНОСТИ 44
Купить

На сегодняшний день для терапии раковых опухолей используется большое количество химических соединений с различным механизмом действия. Сочетание нескольких препаратов для достижения наибольшего терапевтического эффекта лежит в основе комбинированной терапии - одного из самых эффективных подходов к лечению рака. Однако, применение данного похода требует глубокого понимания молекулярных механизмов действия того или иного препарата, так как терапия должна эффективно сдерживать рост и пролиферацию раковых клеток и быть при этом максимально безопасной для здоровых клеток.
Опухолевые клетки обладают особыми свойствами, отличающими их от нормальных клеток. Для них характерен неограниченный и независимый от внешних факторов рост, отсутствие чувствительности к негативным регуляторам пролиферации, блок программ апоптоза, нестабильный кариотип, а также способность к метастазированию.
Ингибиторы гистоновых деацетилаз способны останавливать пролиферацию опухолевых клеток в дозах, нетоксичных для нормальных клеток, что делает их перспективными терапевтическими агентами. Исследования влияния ингибиторов гистоновых деацетилаз на пролиферацию трансформированных клеток показали, что их применение вызывает остановку клеточного цикла, апоптоз, старение и/или дифференцировку. Однако механизмы, с помощью которых ингибиторы деацетилаз гистонов оказывают такой эффект на трансформированные клетки, пока еще до конца не выяснены. Помимо регуляции ацетилирования гистонов, гистоновые деацетилазы способны изменять уровень ацетилирования некоторых других субстратов, в том числе транскрипционных факторов, поэтому эффект, вызываемый ингибиторами деацетилаз гистонов, не сводится к активации транскрипции генов, обусловленной релаксацией хроматина.
Онкоген-трансформированные линии клеток являются удобными моделями для исследования механизмов действия терапевтических агентов. В лаборатории МОДК Института Цитологии выведена линия mERas - линия эмбриональных мышиных фибробластов (MEF), трансформированных комплементирующими онкогенами E1A аденовируса 5-го типа человека и cHa-ras, несущим активирующие точечные мутации в кодонах 12 и 61. Исследование клеток, трансформированных онкогенами Е1А и cHa-ras, показало, что они обладают основными свойствами опухолевых клеток и не способны реализовывать блоки клеточного цикла в условиях сывороточного голодания, а также при воздействии факторов стресса и ДНК-повреждающих агентов (Поспелова и др., 1990).
Ранее было установлено, что ингибиторы деацетилаз гистонов вызывают в E1A+Ras- трансформированных клетках G1/S блок клеточного цикла и старение (Abramova et al., 2006; Romanov et al., 2010). Данный эффект достигается при концентрациях бутирата натрия, нетоксичных для нормальных клеток. Этот факт способен сыграть важную роль в терапии раковых заболеваний, поэтому исследование его молекулярных механизмов имеет серьёзное практическое значение.
Описанные эффекты ингибиторов гистоновых деацетилаз связаны с процессами, в регуляцию которых вовлечены транскрипционные факторы FoxO - консервативные белки с широким спектром клеточных функций. Процессы пролиферации, апоптоза, окислительного стресса и старения контролируются генами-мишенями FoxO, что делает их интересным объектом исследования в рамках изучения механизма действия ингибиторов гистоновых деацетилаз в опухолевых клетках.
Целью работы является изучение влияния ингибиторов гистоновых деацетилаз на транскрипционные факторы семейства FoxO в трансформированных и опухолевых клетках в зависимости от экспрессии аденовирусного Е1А. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Установить взаимосвязь между экспрессией FoxO и уровнем окислительного стресса при действии HDACi
2. Сравнить влияние ингибиторов деацетилаз гистонов на экспрессию FoxO в клетках с различным статусом Е1А
3. Проанализировать активность белков FoxO при ингибировании деацетилаз гистонов в Е1А-экспрессирующих и не экспрессирующих трансформированных клетках
4. Исследовать возможные механизмы модулирования экспрессии FoxO ингибиторами гистоновых деацетилаз в E1A+Ras трансформированных клетках.
Купить