Тип работы:
 Предмет:
 Язык работы:


Роль экзосом и микровезикул в транспорте внеклеточных протеасом раковыми клетками человека

Работа №123344

Тип работы

Дипломные работы, ВКР

Предмет

биология

Объем работы34
Год сдачи2017
Стоимость4270 руб.
ПУБЛИКУЕТСЯ ВПЕРВЫЕ
Просмотрено
20
Не подходит работа?

Узнай цену на написание


Введение 3
Цель работы 4
Задачи 4
Обзор литературы 5
Строение и функции протеасомы 5
Убиквитин-протеасомная система 8
Внеклеточные протеасомы 9
Механизмы транспорта внеклеточных протеасом 11
Материалы и методы 13
Работа с клетками эукариот в культуре 13
Молекулярно-биохимические методы 14
Статистический анализ 18
Результаты 19
Зависимость появления протеасом в среде культивирования клеток К562 от времени 19
Анализ присутствия протеасом во внеклеточных везикулах клеток человека линии К562 20
Анализ присутствия протеасом во внеклеточных везикулах клеток человека линии RPMI-8226 23
Влияние ингибиторов везикулярного транспорта на количество внеклеточных протеасом в кондиционируемой клетками RPMI-8226 среде. 24
Влияние ингибиторов везикулярного транспорта на количество внеклеточных протеасом в кондиционируемой К562 среде. 25
Обсуждение 27
Выводы 30
Список использованной литературы 31


Любая клетка нуждается в своевременной утилизации белков. Причины могут быть разные: белок может быть поврежден, может иметь неправильную третичную структуру, может пройти срок его жизни или исчезнуть необходимость в его функциях. Для антиген-презентирующих клеток для выполнения их специализированных функций также необходима возможность разрезания белков на пептиды.
Один из главных компонентов внутриклеточного протеолиза –протеасома – сложный белковый комплекс, состоящий из мультисубъединичной коровой частицы, обладающий пептидазной активностью, и различных регуляторных частиц. Протеасома способна как на АТФ- и убиквитин-зависимое расщепление белков, предназначенных к деградации убиквитин-протеасомной системой, так и на АТФ- и убиквитин-независимую деградацию денатурированных и некоторых других белков. Протеасома широко распространена среди всех существующих доменов жизни: сначала она была обнаружена у всех изученных эукариотических организмов, затем её существование было показано у архейи у бактерий порядка Actinomycetales(Maupin-Furlowetal., 2006). При этом её структура на удивление консервативна, что указывает на её исключительную значимость для жизнедеятельности клетки. Известно, что убиквитин-протеасомная система участвует в таких важных процессах, как регуляция клеточного цикла, репарация ДНК, выход клетки в дифференцировку и апоптоз(IrinaM. Konstantinovaetal., 2008).
В ходе исследований было показано, что протеасомы обнаруживаются не только внутри клеток, но и в плазме крови, альвеолярной и спинномозговой жидкостях, а также в среде культивирования клеток (Kulichkovaetal., 2004; Muelleretal., 2012; Sixtetal., 2007; Wadaetal., 1993). Такие протеасомы названы внеклеточными. Для протеасом плазмы крови используется отдельный термин: циркуляторные протеасомы (ц-протеасомы). Была выявлена связь между концентрацией внеклеточных и циркуляторных протеасом с такими заболеваниями, как острый респираторный дистресс-синдром, твердые опухоли, гепатома, множественная миелома. При этом концентрация зависит от стадии онкологического заболевания и является важным показателем для прогнозирования продолжительности жизни пациентов (Jakobetal., 2007).
Несмотря на обширные исследования зависимости концентрации внеклеточных протеасом с различными заболеваниями, до сих пор нет однозначного ответа по поводу механизмов выхода протеасом из клеток. Изначальное предположение, что появление протеасом во внеклеточном пространстве происходит при разрушении клетки, опровергается тем, что, во-первых, в исследуемых внеклеточных жидкостях не обнаруживаются в достаточных количествах другие внутриклеточные маркеры, а во-вторых, отличиями в субъединичном составе внутри- и внеклеточных протеасом. Крайне маловероятно, что протеасомы транспортируются во внеклеточное пространство посредством классического пути секреции через шероховатый эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи (WójcikandDeMartino, 2003). Протеасомные субъединицы и протеасомная активность были обнаружены в составе внеклеточных везикул, из чего было сделано предположение что везикулярный механизм секреции может быть основным источником внеклеточных протеасом (Laietal., 2012) (Harasztietal., 2016). Поскольку к классу внеклеточных везикул относятся экзосомы, микровезикулы и апоптотические тельца, на сегодняшний день остается неясным, каким именно везикулярным путем секретируются клетками внеклеточные протеасомы. Таким образом, несомненна актуальность изучения роли экзосом и микровезикул в транспорте внеклеточных протеасом.
Цель работы
Исследовать роль экзосом и микровезикул в транспорте внеклеточных протеасом раковыми клетками человека.
Задачи
1. С помощью последовательного центрифугирования и фильтрации фракционировать среду, кондиционированную клетками человека линий RPMI-8226 и K562, на фракции, содержащие микровезикулы, экзосомы и фракцию, обедненную везикулами. Методом иммуноанализа оценить присутствие протеасомных субъединиц в каждой из полученных фракций
2. Оценить влияние ингибирования везикулярных путей внеклеточного транспорта на уровень внеклеточных протеасом
 


Возникли сложности?

Нужна помощь преподавателя?

Помощь в написании работ!
ДИПЛОМНЫЕ МАГИСТЕРСКИЕ ДИССЕРТАЦИИ
КУРСОВЫЕ СТАТЬИ ВКР

1. В раковых клетках человека К562 и RPMI-8226 лишь небольшая часть внеклеточных протеасом переносится микровезикулами и экзосомами, что позволяет предположить о существовании отдельного механизма транспорта протеасом для раковых клеток.
2. Ингибирование везикулярного транспорта в клетках К562 и RPMI-8226 не оказывает влияния на количество внеклеточных протеасом, что подтверждает предыдущий вывод.



Ben-Nissan, G., and Sharon, M. (2014). Regulating the 20S Proteasome Ubiquitin-Independent Degradation Pathway. Biomolecules 4, 862–884.
Blott, E.J., and Griffiths, G.M. (2002). Secretory lysosomes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 122–131.
Bochmann, I., Ebstein, F., Lehmann, A., Wohlschlaeger, J., Sixt, S.U., Kloetzel, P.-M., and Dahlmann, B. (2014). T lymphocytes export proteasomes by way of microparticles: a possible mechanism for generation of extracellular proteasomes. J. Cell. Mol. Med. 18, 59–68.
Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248–254.
Budenholzer, L., Cheng, C.L., Li, Y., and Hochstrasser, M. (2017). Proteasome Structure and Assembly. J. Mol. Biol.
Dahlmann, B., Ruppert, T., Kuehn, L., Merforth, S., and Kloetzel, P.M. (2000). Different proteasome subtypes in a single tissue exhibit different enzymatic properties. J. Mol. Biol. 303, 643–653.
Daulny, A., and Tansey, W.P. (2009). Damage control: DNA repair, transcription, and the ubiquitin–proteasome system. DNA Repair 8, 444–448.
Ding, Y., Wang, J., Wang, J., Stierhof, Y.-D., Robinson, D.G., and Jiang, L. (2012). Unconventional protein secretion. Trends Plant Sci. 17, 606–615.
Dutaud, D., Aubry, L., Henry, L., Levieux, D., Hendil, K.B., Kuehn, L., Bureau, J.P., and Ouali, A. (2002). Development and evaluation of a sandwich ELISA for quantification of the 20S proteasome in human plasma. J. Immunol. Methods 260, 183–193.
Egerer, K., Kuckelkorn, U., Rudolph, P.E., Rückert, J.C., Dörner, T., Burmester, G.-R., Kloetzel, P.-M., and Feist, E. (2002). Circulating proteasomes are markers of cell damage and immunologic activity in autoimmune diseases. J. Rheumatol. 29, 2045–2052.
Ehlinger, A., and Walters, K.J. (2013). Structural insights into proteasome activation by the 19S regulatory particle. Biochemistry (Mosc.) 52, 3618–3628.
Frentzel, S., Pesold-Hurt, B., Seelig, A., and Kloetzel, P.M. (1994). 20 S proteasomes are assembled via distinct precursor complexes. Processing of LMP2 and LMP7 proproteins takes place in 13-16 S preproteasome complexes. J. Mol. Biol. 236, 975–981.
Glickman, M.H., and Ciechanover, A. (2002). The Ubiquitin-Proteasome Proteolytic Pathway: Destruction for the Sake of Construction. Physiol. Rev. 82, 373–428.
Groll, M., Ditzel, L., Löwe, J., Stock, D., Bochtler, M., Bartunik, H.D., and Huber, R. (1997). Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature 386, 463–471.
Haraszti, R.A., Didiot, M.-C., Sapp, E., Leszyk, J., Shaffer, S.A., Rockwell, H.E., Gao, F., Narain, N.R., DiFiglia, M., Kiebish, M.A., et al. (2016). High-resolution proteomic and lipidomic analysis of exosomes and microvesicles from different cell sources. J. Extracell. Vesicles 5.
Hardeland, U., Kunz, C., Focke, F., Szadkowski, M., and Schar, P. (2007). Cell cycle regulation as a mechanism for functional separation of the apparently redundant uracil DNA glycosylases TDG and UNG2. Nucleic Acids Res. 35, 3859–3867.
Heubner, M., Wimberger, P., Dahlmann, B., Kasimir-Bauer, S., Kimmig, R., Peters, J., Wohlschlaeger, J., and Sixt, S.U. (2011). The prognostic impact of circulating proteasome concentrations in patients with epithelial ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 120, 233–238.
Hough, R., Pratt, G., and Rechsteiner, M. (1987). Purification of two high molecular weight proteases from rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 262, 8303–8313.
Huang, T.T., and D’Andrea, A.D. (2006). Regulation of DNA repair by ubiquitylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 323–334.
Inobe, T., and Matouschek, A. (2014). Paradigms of protein degradation by the proteasome. Curr. Opin. Struct. Biol. 24, 156–164.
Irina M. Konstantinova, Anna S. Tsimokha, and Alexey G. Mittenberg (2008). Role of Proteasomes in Cellular Regulation. In International Review of Cell and Molecular Biology, (Elsevier), pp. 125–181.
Jakob, C., Egerer, K., Liebisch, P., Türkmen, S., Zavrski, I., Kuckelkorn, U., Heider, U., Kaiser, M., Fleissner, C., Sterz, J., et al. (2007). Circulating proteasome levels are an independent prognostic factor for survival in multiple myeloma. Blood 109, 2100–2105.
Jeppesen, D.K., Hvam, M.L., Primdahl-Bengtson, B., Boysen, A.T., Whitehead, B., Dyrskjøt, L., Ørntoft, T.F., Howard, K.A., and Ostenfeld, M.S. (2014). Comparative analysis of discrete exosome fractions obtained by differential centrifugation. J. Extracell. Vesicles 3, 25011.
Kisselev, A.F., Akopian, T.N., Woo, K.M., and Goldberg, A.L. (1999). The sizes of peptides generated from protein by mammalian 26 and 20 S proteasomes. Implications for understanding the degradative mechanism and antigen presentation. J. Biol. Chem. 274, 3363–3371.
Kisselev, A.F., Garcia-Calvo, M., Overkleeft, H.S., Peterson, E., Pennington, M.W., Ploegh, H.L., Thornberry, N.A., and Goldberg, A.L. (2003). The Caspase-like Sites of Proteasomes, Their Substrate Specificity, New Inhibitors and Substrates, and Allosteric Interactions with the Trypsin-like Sites. J. Biol. Chem. 278, 35869–35877.
Kloetzel, P.-M. (2001). Ubiquitin and proteasomes: Antigen processing by the proteasome. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 179.
Kueltzo, L.A., and Middaugh, C.R. (2003). Nonclassical transport proteins and peptides: an alternative to classical macromolecule delivery systems. J. Pharm. Sci. 92, 1754–1772.
Kulichkova, V.A., Mittenberg, A.G., Ermolaeva, Y. u B., Tsimokha, A.S., Volkova, I.V., Evteeva, I.N., Kozyukharova, I.V., Gauze, L.N., and Konstantinova, I.M. (2004). Specificity of the proteasome population secreted from cells into the culture medium. Dokl. Biol. Sci. Proc. Acad. Sci. USSR Biol. Sci. Sect. 399, 503–506.
Kumatori, A., Tanaka, K., Inamura, N., Sone, S., Ogura, T., Matsumoto, T., Tachikawa, T., Shin, S., and Ichihara, A. (1990). Abnormally high expression of proteasomes in human leukemic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 7071–7075.
Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680–685.
Lai, R.C., Tan, S.S., Teh, B.J., Sze, S.K., Arslan, F., de Kleijn, D.P., Choo, A., and Lim, S.K. (2012). Proteolytic Potential of the MSC Exosome Proteome: Implications for an Exosome-Mediated Delivery of Therapeutic Proteasome. Int. J. Proteomics 2012.
Lavabre-Bertrand, T., Henry, L., Carillo, S., Guiraud, I., Ouali, A., Dutaud, D., Aubry, L., Rossi, J.F., and Bureau, J.P. (2001). Plasma proteasome level is a potential marker in patients with solid tumors and hemopoietic malignancies. Cancer 92, 2493–2500.
Liang, B., Peng, P., Chen, S., Li, L., Zhang, M., Cao, D., Yang, J., Li, H., Gui, T., Li, X., et al. (2013). Characterization and proteomic analysis of ovarian cancer-derived exosomes. J. Proteomics 80, 171–182.
Liu, M., Dhanwada, K.R., Birt, D.F., Hecht, S., and Pelling, J.C. (1994). Increase in p53 protein half-life in mouse keratinocytes following UV-B irradiation. Carcinogenesis 15, 1089–1092.
Löwe, J., Stock, D., Jap, B., Zwickl, P., Baumeister, W., and Huber, R. (1995). Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science 268, 533–539.
Lynnerup, N., Kjeldsen, H., Heegaard, S., Jacobsen, C., and Heinemeier, J. (2008). Radiocarbon Dating of the Human Eye Lens Crystallines Reveal Proteins without Carbon Turnover throughout Life. PLoS ONE 3.
Maupin-Furlow, J. (2012). Proteasomes and protein conjugation across domains of life. Nat. Rev. Microbiol. 10, 100–111.
Maupin-Furlow, J.A., Humbard, M.A., Kirkland, P.A., Li, W., Reuter, C.J., Wright, A.J., and Zhou, G. (2006). Proteasomes from structure to function: perspectives from Archaea. Curr. Top. Dev. Biol. 75, 125–169.
Mittenberg, A.G., Moiseeva, T.N., and Barlev, N.A. (2008). Role of proteasomes in transcription and their regulation by covalent modifications. Front. Biosci. J. Virtual Libr. 13, 7184–7192.
Mueller, O., Anlasik, T., Wiedemann, J., Thomassen, J., Wohlschlaeger, J., Hagel, V., Keyvani, K., Schwieger, I., Dahlmann, B., Sure, U., et al. (2012). Circulating extracellular proteasome in the cerebrospinal fluid: a study on concentration and proteolytic activity. J. Mol. Neurosci. MN 46, 509–515.
Murata, S., Sasaki, K., Kishimoto, T., Niwa, S.-I., Hayashi, H., Takahama, Y., and Tanaka, K. (2007). Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science 316, 1349–1353.
Nandi, D., Woodward, E., Ginsburg, D.B., and Monaco, J.J. (1997). Intermediates in the formation of mouse 20S proteasomes: implications for the assembly of precursor beta subunits. EMBO J. 16, 5363–5375.
Otero, M.G., Alloatti, M., Cromberg, L.E., Almenar-Queralt, A., Encalada, S.E., PozoDevoto, V.M., Bruno, L., Goldstein, L.S.B., and Falzone, T.L. (2014). Fast axonal transport of the proteasome complex depends on membrane interaction and molecular motor function. J. Cell Sci. 127, 1537–1549.
Qian, M.-X., Pang, Y., Liu, C.H., Haratake, K., Du, B.-Y., Ji, D.-Y., Wang, G.-F., Zhu, Q.-Q., Song, W., Yu, Y., et al. (2013). Acetylation-Mediated Proteasomal Degradation of Core Histones during DNA Repair and Spermatogenesis. Cell 153, 1012–1024.
Qureshi, N., Vogel, S.N., Van Way, C., Papasian, C.J., Qureshi, A.A., and Morrison, D.C. (2005). The proteasome: A Central Regulator of Inflammation and Macrophage Function. Immunol. Res. 31, 243–260.
Radivojac, P., Vacic, V., Haynes, C., Cocklin, R.R., Mohan, A., Heyen, J.W., Goebl, M.G., and Iakoucheva, L.M. (2010). Identification, analysis, and prediction of protein ubiquitination sites. Proteins 78, 365–380.
Raiborg, C., and Stenmark, H. (2009). The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature 458, 445–452.
Raposo, G., and Stoorvogel, W. (2013). Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J. Cell Biol. 200, 373–383.
Ravid, T., and Hochstrasser, M. (2008). Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 679–690.
Roth, G.A., Moser, B., Krenn, C., Roth‐Walter, F., Hetz, H., Richter, S., Brunner, M., Jensen‐Jarolim, E., Wolner, E., Hoetzenecker, K., et al. (2005). Heightened levels of circulating 20S proteasome in critically ill patients. Eur. J. Clin. Invest. 35, 399–403.
Savina, A., Furlán, M., Vidal, M., and Colombo, M.I. (2003). Exosome Release Is Regulated by a Calcium-dependent Mechanism in K562 Cells. J. Biol. Chem. 278, 20083–20090.
Simpson, M.V. (1953). The release of labeled amino acids from the proteins of rat liver slices. J. Biol. Chem. 201, 143–154.
Sixt, S.U., and Dahlmann, B. (2008). Extracellular, circulating proteasomes and ubiquitin — Incidence and relevance. Biochim. Biophys. Acta BBA - Mol. Basis Dis. 1782, 817–823.
Sixt, S.U., and Peters, J. (2010). Extracellular alveolar proteasome: possible role in lung injury and repair. Proc. Am. Thorac. Soc. 7, 91–96.
Sixt, S.U., Beiderlinden, M., Jennissen, H.P., and Peters, J. (2007). Extracellular proteasome in the human alveolar space: a new housekeeping enzyme? Am. J. Physiol.-Lung Cell. Mol. Physiol. 292, L1280–L1288.
Sixt, S.U., Costabel, U., Bonella, F., Grunert, K., Alami, R., Hakenbeck, J., Bauer, P., Dahlmann, B., Schmid, K.W., Peters, J., et al. (2014). Alveolar and intraparenchymal proteasome in sarcoidosis. Respir. Med. 108, 1534–1541.
Smith, D.M., Benaroudj, N., and Goldberg, A. (2006). Proteasomes and their associated ATPases: A destructive combination. J. Struct. Biol. 156, 72–83.
Vlachostergios, P.J., Patrikidou, A., Daliani, D.D., and Papandreou, C.N. (2009). The ubiquitin-proteasome system in cancer, a major player in DNA repair. Part 1: post-translational regulation. J. Cell. Mol. Med. 13, 3006–3018.
Wada, M., Kosaka, M., Saito, S., Sano, T., Tanaka, K., and Ichihara, A. (1993). Serum concentration and localization in tumor cells of proteasomes in patients with hematologic malignancy and their pathophysiologic significance. J. Lab. Clin. Med. 121, 215–223.
Wang, Z., Hill, S., Luther, J.M., Hachey, D.L., and Schey, K.L. (2012). Proteomic analysis of urine exosomes by multidimensional protein identification technology (MudPIT). Proteomics 12, 329–338.
Wawrzynczak, E. (2006). Prognostic proteasome.
Waxman, L., Fagan, J.M., and Goldberg, A.L. (1987). Demonstration of two distinct high molecular weight proteases in rabbit reticulocytes, one of which degrades ubiquitin conjugates. J. Biol. Chem. 262, 2451–2457.
Wilkinson, K.D. (2005). The discovery of ubiquitin-dependent proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 15280–15282.
Wójcik, C., and DeMartino, G.N. (2003). Intracellular localization of proteasomes. Int. J. Biochem. Cell Biol. 35, 579–589.
Zoeger, A., Blau, M., Egerer, K., Feist, E., and Dahlmann, B. (2006). Circulating Proteasomes Are Functional and Have a Subtype Pattern Distinct from 20S Proteasomes in Major Blood Cells. Clin. Chem. 52, 2079–2086.
Зайкова Ю.Я., Куличкова В.А., Гаузе Л.Н., Ермолаева Ю.Б., and Цимоха А.С. (2011). Сравнительный анализ вне- и внутриклеточных протеасом клеток человека линии к562. Цитология.
Зайкова Ю.Я., Куличкова В.А., Митенкова К.А., andЦимоха А.С. (2014). Способы выделения и очистки внеклеточных протеасом и оценка их пептидазных активностей. Цитология.

Работу высылаем на протяжении 30 минут после оплаты.




©2025 Cервис помощи студентам в выполнении работ
.