Представленный материал является образцом учебного исследования, примером структуры и содержания учебного исследования по заявленной теме. Размещён исключительно в информационных и ознакомительных целях.
Workspay.ru оказывает информационные услуги по сбору, обработке и структурированию материалов в соответствии с требованиями заказчика.
Размещение материала не означает публикацию произведения впервые и не предполагает передачу исключительных авторских прав третьим лицам.
Материал не предназначен для дословной сдачи в образовательные организации и требует самостоятельной переработки с соблюдением законодательства Российской Федерации об авторском праве и принципов академической добросовестности.
Авторские права на исходные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае возникновения вопросов, связанных с размещённым материалом, просим направить обращение через форму обратной связи.
ℹ️Настоящий учебно-методический информационный материал размещён в ознакомительных и исследовательских целях и представляет собой пример учебного исследования. Не является готовым научным трудом и требует самостоятельной переработки.
Введение 3
Цель работы 4
Задачи 4
Обзор литературы 5
Строение и функции протеасомы 5
Убиквитин-протеасомная система 8
Внеклеточные протеасомы 9
Механизмы транспорта внеклеточных протеасом 11
Материалы и методы 13
Работа с клетками эукариот в культуре 13
Молекулярно-биохимические методы 14
Статистический анализ 18
Результаты 19
Зависимость появления протеасом в среде культивирования клеток К562 от времени 19
Анализ присутствия протеасом во внеклеточных везикулах клеток человека линии К562 20
Анализ присутствия протеасом во внеклеточных везикулах клеток человека линии RPMI-8226 23
Влияние ингибиторов везикулярного транспорта на количество внеклеточных протеасом в кондиционируемой клетками RPMI-8226 среде. 24
Влияние ингибиторов везикулярного транспорта на количество внеклеточных протеасом в кондиционируемой К562 среде. 25
Обсуждение 27
Выводы 30
Список использованной литературы 31
📖 Введение
Любая клетка нуждается в своевременной утилизации белков. Причины могут быть разные: белок может быть поврежден, может иметь неправильную третичную структуру, может пройти срок его жизни или исчезнуть необходимость в его функциях. Для антиген-презентирующих клеток для выполнения их специализированных функций также необходима возможность разрезания белков на пептиды.
Один из главных компонентов внутриклеточного протеолиза –протеасома – сложный белковый комплекс, состоящий из мультисубъединичной коровой частицы, обладающий пептидазной активностью, и различных регуляторных частиц. Протеасома способна как на АТФ- и убиквитин-зависимое расщепление белков, предназначенных к деградации убиквитин-протеасомной системой, так и на АТФ- и убиквитин-независимую деградацию денатурированных и некоторых других белков. Протеасома широко распространена среди всех существующих доменов жизни: сначала она была обнаружена у всех изученных эукариотических организмов, затем её существование было показано у архейи у бактерий порядка Actinomycetales(Maupin-Furlowetal., 2006). При этом её структура на удивление консервативна, что указывает на её исключительную значимость для жизнедеятельности клетки. Известно, что убиквитин-протеасомная система участвует в таких важных процессах, как регуляция клеточного цикла, репарация ДНК, выход клетки в дифференцировку и апоптоз(IrinaM. Konstantinovaetal., 2008).
В ходе исследований было показано, что протеасомы обнаруживаются не только внутри клеток, но и в плазме крови, альвеолярной и спинномозговой жидкостях, а также в среде культивирования клеток (Kulichkovaetal., 2004; Muelleretal., 2012; Sixtetal., 2007; Wadaetal., 1993). Такие протеасомы названы внеклеточными. Для протеасом плазмы крови используется отдельный термин: циркуляторные протеасомы (ц-протеасомы). Была выявлена связь между концентрацией внеклеточных и циркуляторных протеасом с такими заболеваниями, как острый респираторный дистресс-синдром, твердые опухоли, гепатома, множественная миелома. При этом концентрация зависит от стадии онкологического заболевания и является важным показателем для прогнозирования продолжительности жизни пациентов (Jakobetal., 2007).
Несмотря на обширные исследования зависимости концентрации внеклеточных протеасом с различными заболеваниями, до сих пор нет однозначного ответа по поводу механизмов выхода протеасом из клеток. Изначальное предположение, что появление протеасом во внеклеточном пространстве происходит при разрушении клетки, опровергается тем, что, во-первых, в исследуемых внеклеточных жидкостях не обнаруживаются в достаточных количествах другие внутриклеточные маркеры, а во-вторых, отличиями в субъединичном составе внутри- и внеклеточных протеасом. Крайне маловероятно, что протеасомы транспортируются во внеклеточное пространство посредством классического пути секреции через шероховатый эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи (WójcikandDeMartino, 2003). Протеасомные субъединицы и протеасомная активность были обнаружены в составе внеклеточных везикул, из чего было сделано предположение что везикулярный механизм секреции может быть основным источником внеклеточных протеасом (Laietal., 2012) (Harasztietal., 2016). Поскольку к классу внеклеточных везикул относятся экзосомы, микровезикулы и апоптотические тельца, на сегодняшний день остается неясным, каким именно везикулярным путем секретируются клетками внеклеточные протеасомы. Таким образом, несомненна актуальность изучения роли экзосом и микровезикул в транспорте внеклеточных протеасом.
Цель работы
Исследовать роль экзосом и микровезикул в транспорте внеклеточных протеасом раковыми клетками человека.
Задачи
1. С помощью последовательного центрифугирования и фильтрации фракционировать среду, кондиционированную клетками человека линий RPMI-8226 и K562, на фракции, содержащие микровезикулы, экзосомы и фракцию, обедненную везикулами. Методом иммуноанализа оценить присутствие протеасомных субъединиц в каждой из полученных фракций
2. Оценить влияние ингибирования везикулярных путей внеклеточного транспорта на уровень внеклеточных протеасом
✅ Заключение
1. В раковых клетках человека К562 и RPMI-8226 лишь небольшая часть внеклеточных протеасом переносится микровезикулами и экзосомами, что позволяет предположить о существовании отдельного механизма транспорта протеасом для раковых клеток.
2. Ингибирование везикулярного транспорта в клетках К562 и RPMI-8226 не оказывает влияния на количество внеклеточных протеасом, что подтверждает предыдущий вывод.