Исследование жизненной активности пробиотических микроорганизмов методом флуориметрии
|
Введение 12
1 Литературный обзор 14
1.1 Пробиотические микроорганизмы 14
1.2 Характеристика лактобактерий 25
1.3 Характеристика колибактерий 26
1.4 Методы изучения ферментативной активности бактерий 27
1.5 Характеристика кислотно-основных индикаторов 29
1.5.1 Индикатор бромкрезоловый зеленый 29
1.5.2 Индикатор метил-тимоловый синий 30
1.5.3 Индикатор бромкрезоловый красный (пурпурный) 30
1.6 Люминесценция 32
1.7 Промышленное культивирование микроорганизмов 35
1.7.1 Основные этапы общей схемы микробиологического
производства
35
1.7.2 Выращивание микроорганизмов в реакторе и контроль
процесса культивирования
38
1.7.2.1 Промышленное культивирование микроорганизмов с
применением активной аэрации
39
1.7.2.2 Технология культивирования микроорганизмов в покоящемся
состоянии без аэрации
40
1.7.2.3 Технология промышленного культивирования анаэробных
микроорганизмов
40
1.7.3 Периодические и хемостатные системы культивирования
микроорганизмов
41
1.7.3.1 Технологическая схема глубинного культивирования 42
2 Аппаратура и методика эксперимента 46
2.1 Аппаратурное оформление 46
2.2 Объекты исследования 47
2.3 Приготовление суспензии бактерий и растворов индикаторов и
методика эксперимента
48
3 Исследование оптических свойств кислотно-основных индикаторов
в присутствии лактобактерий
49
3.1 Индикатор метил-тимоловый синий 4910
3.2 Индикатор бромкрезоловый зеленый 49
3.3 Индикатор бромкрезоловый красный 49
3.4 Исследование влияния pH на индикатор бромкрезоловый
красный
50
3.5 Исследование взаимодействия лактобактерий с бромкрезоловым
красным при различных концентрациях индикатора
52
4 Исследование оптических свойств индикатора бромкрезолового
красного в присутствии колибактерий
56
4.1 Исследование оптических свойств индикатора бромкрезолового
красного фотометрическим методом
56
4.2 Исследование взаимодействия колибактрий с бромкрезоловым
красным
58
5 Финансовый менеджмент, ресурсоэффективность и
ресурсосбережение
67
5.1 Оценка коммерческого потенциала и перспективности
проведения научных исследований с позиции ресурсоэффективности
и ресурсосбережения
67
5.1.1 Потенциальные потребители результатов исследования 68
5.1.2 Анализ конкурентных технических решений с позиции
ресурсоэффективности и ресурсосбережения
69
5.1.3 Диаграмма Исикава 70
5.1.4 Оценка готовности проекта к коммерциализации 70
5.1.5 Методы коммерциализации результатов
научно-технического исследования
72
5.2 Инициация проекта 73
5.3 Планирование управления научно-техническим проектом 76
5.3.1 Иерархическая структура работ проекта 76
5.3.2 Контрольные события проекта 77
5.3.3 План проекта 78
5.3.4 Бюджет научного исследования 80
5.3.5 Организационная структура проекта 85
5.3.6 Матрица ответственности 86
5.3.7 План управления коммуникациями проекта 87
5.3.8 Реестр рисков проекта 88
5.4 Определение ресурсной (ресурсосберегающей), финансовой, 8811
бюджетной, социальной и экономической эффективности
исследования
5.4.1 Оценка сравнительной эффективности исследования 89
6 Социальная ответственность 93
6.1 Профессиональная социальная безопасность 94
6.1.1 Анализ вредных производственных факторов и обоснование
мероприятий по их устранению
95
6.1.2 Анализ опасных производственных факторов и обоснование
мероприятий по их устранению (техника безопасности)
100
6.2 Экологическая безопасность (охрана окружающей среды) 103
6.3 Безопасность в чрезвычайных ситуациях 104
6.4 Правовые вопросы обеспечения безопасности 105
Заключение 107
Список публикаций 109
Список литературы 110
Приложение А 113
1 Литературный обзор 14
1.1 Пробиотические микроорганизмы 14
1.2 Характеристика лактобактерий 25
1.3 Характеристика колибактерий 26
1.4 Методы изучения ферментативной активности бактерий 27
1.5 Характеристика кислотно-основных индикаторов 29
1.5.1 Индикатор бромкрезоловый зеленый 29
1.5.2 Индикатор метил-тимоловый синий 30
1.5.3 Индикатор бромкрезоловый красный (пурпурный) 30
1.6 Люминесценция 32
1.7 Промышленное культивирование микроорганизмов 35
1.7.1 Основные этапы общей схемы микробиологического
производства
35
1.7.2 Выращивание микроорганизмов в реакторе и контроль
процесса культивирования
38
1.7.2.1 Промышленное культивирование микроорганизмов с
применением активной аэрации
39
1.7.2.2 Технология культивирования микроорганизмов в покоящемся
состоянии без аэрации
40
1.7.2.3 Технология промышленного культивирования анаэробных
микроорганизмов
40
1.7.3 Периодические и хемостатные системы культивирования
микроорганизмов
41
1.7.3.1 Технологическая схема глубинного культивирования 42
2 Аппаратура и методика эксперимента 46
2.1 Аппаратурное оформление 46
2.2 Объекты исследования 47
2.3 Приготовление суспензии бактерий и растворов индикаторов и
методика эксперимента
48
3 Исследование оптических свойств кислотно-основных индикаторов
в присутствии лактобактерий
49
3.1 Индикатор метил-тимоловый синий 4910
3.2 Индикатор бромкрезоловый зеленый 49
3.3 Индикатор бромкрезоловый красный 49
3.4 Исследование влияния pH на индикатор бромкрезоловый
красный
50
3.5 Исследование взаимодействия лактобактерий с бромкрезоловым
красным при различных концентрациях индикатора
52
4 Исследование оптических свойств индикатора бромкрезолового
красного в присутствии колибактерий
56
4.1 Исследование оптических свойств индикатора бромкрезолового
красного фотометрическим методом
56
4.2 Исследование взаимодействия колибактрий с бромкрезоловым
красным
58
5 Финансовый менеджмент, ресурсоэффективность и
ресурсосбережение
67
5.1 Оценка коммерческого потенциала и перспективности
проведения научных исследований с позиции ресурсоэффективности
и ресурсосбережения
67
5.1.1 Потенциальные потребители результатов исследования 68
5.1.2 Анализ конкурентных технических решений с позиции
ресурсоэффективности и ресурсосбережения
69
5.1.3 Диаграмма Исикава 70
5.1.4 Оценка готовности проекта к коммерциализации 70
5.1.5 Методы коммерциализации результатов
научно-технического исследования
72
5.2 Инициация проекта 73
5.3 Планирование управления научно-техническим проектом 76
5.3.1 Иерархическая структура работ проекта 76
5.3.2 Контрольные события проекта 77
5.3.3 План проекта 78
5.3.4 Бюджет научного исследования 80
5.3.5 Организационная структура проекта 85
5.3.6 Матрица ответственности 86
5.3.7 План управления коммуникациями проекта 87
5.3.8 Реестр рисков проекта 88
5.4 Определение ресурсной (ресурсосберегающей), финансовой, 8811
бюджетной, социальной и экономической эффективности
исследования
5.4.1 Оценка сравнительной эффективности исследования 89
6 Социальная ответственность 93
6.1 Профессиональная социальная безопасность 94
6.1.1 Анализ вредных производственных факторов и обоснование
мероприятий по их устранению
95
6.1.2 Анализ опасных производственных факторов и обоснование
мероприятий по их устранению (техника безопасности)
100
6.2 Экологическая безопасность (охрана окружающей среды) 103
6.3 Безопасность в чрезвычайных ситуациях 104
6.4 Правовые вопросы обеспечения безопасности 105
Заключение 107
Список публикаций 109
Список литературы 110
Приложение А 113
Дипломная работа посвящена поиску и созданию новых способов
определения жизненной активности микроорганизмов, с целью
усовершенствования контроля технологического процесса их
культивирования.
При выполнении данной работы в качестве пробиотических
микроорганизмов были выбраны наиболее широко распространѐнные
лактобактерии и колибактерии.
В качестве индикатора для определения жизненной активности
исследуемых микроорганизмов был выбран кислотно – основной индикатор
бромкрезоловый красный.
Исследование оптических свойств кислотно-основных индикаторов в
контексте определения жизненной активности микроорганизмов ранее не
проводилось и является новым подходом.
Данная дипломная работа состоит из введения, литературного обзора,
экспериментальной части, заключения, списка литературы.
Введение
Пробиотики входят в состав функциональных продуктов питания,
потребление которых с каждым годом неуклонно растет. Традиционно, к
пробиотическим микроорганизмам относятся лактобактерии и колибактерии.
Активное развитие промышленного культивирования пробиотических
микроорганизмов предполагает совершенствование методов определения
качественного и количественного состава культивируемых бактерий, а также,
определение их жизненной активности, поскольку только живые
пробиотические микроорганизмы приносят пользу здоровью человека.
Процесс промышленного культивирования микроорганизмов состоит
из нескольких этапов и проводится в специальных аппаратах – биореакторах.
Существуют различные приемы проведения процесса культивирования,
однако, в независимости от применяемого способа необходим контроль
жизненной активности культивируемых микроорганизмов. Известен ряд
способов определения жизненной активности микроорганизмов, например,
измерение количества содержащегося в культуральной жидкости кислорода,
определение активности ферментов метаболизма микроорганизмов,
определение выделяемых продуктов метаболизма и т.д.
Актуальной задачей является поиск и создание новых способов
определения жизненной активности микроорганизмов, с целью
усовершенствования контроля качества продукции, производимой в ходе
технологического процесса культивирования.
Для решения данной задачи одними из перспективных методов
являются спектроскопические методы, в частности, флуориметрия и
фотометрия. Данные методы уже находят применение в биотехнологическом
производстве для проведения микробиологических исследований.
Также, немаловажную роль в исследовании микроорганизмов играют
кислотно-основные индикаторы, которые применяются в качестве добавки к
питательной среде с целью определения значений рН образующихся13
продуктов метаболизма, однако, исследование оптических свойств
индикаторов в контексте определения жизненной активности
микроорганизмов ранее не проводилось. В связи с этим, научная новизна
работы заключается в применении спектроскопических методов анализа для
определения жизненной активности микроорганизмов по изменению
оптических свойств ряда кислотно-основных индикаторов за счет выработки
определенных продуктов метаболизма.
определения жизненной активности микроорганизмов, с целью
усовершенствования контроля технологического процесса их
культивирования.
При выполнении данной работы в качестве пробиотических
микроорганизмов были выбраны наиболее широко распространѐнные
лактобактерии и колибактерии.
В качестве индикатора для определения жизненной активности
исследуемых микроорганизмов был выбран кислотно – основной индикатор
бромкрезоловый красный.
Исследование оптических свойств кислотно-основных индикаторов в
контексте определения жизненной активности микроорганизмов ранее не
проводилось и является новым подходом.
Данная дипломная работа состоит из введения, литературного обзора,
экспериментальной части, заключения, списка литературы.
Введение
Пробиотики входят в состав функциональных продуктов питания,
потребление которых с каждым годом неуклонно растет. Традиционно, к
пробиотическим микроорганизмам относятся лактобактерии и колибактерии.
Активное развитие промышленного культивирования пробиотических
микроорганизмов предполагает совершенствование методов определения
качественного и количественного состава культивируемых бактерий, а также,
определение их жизненной активности, поскольку только живые
пробиотические микроорганизмы приносят пользу здоровью человека.
Процесс промышленного культивирования микроорганизмов состоит
из нескольких этапов и проводится в специальных аппаратах – биореакторах.
Существуют различные приемы проведения процесса культивирования,
однако, в независимости от применяемого способа необходим контроль
жизненной активности культивируемых микроорганизмов. Известен ряд
способов определения жизненной активности микроорганизмов, например,
измерение количества содержащегося в культуральной жидкости кислорода,
определение активности ферментов метаболизма микроорганизмов,
определение выделяемых продуктов метаболизма и т.д.
Актуальной задачей является поиск и создание новых способов
определения жизненной активности микроорганизмов, с целью
усовершенствования контроля качества продукции, производимой в ходе
технологического процесса культивирования.
Для решения данной задачи одними из перспективных методов
являются спектроскопические методы, в частности, флуориметрия и
фотометрия. Данные методы уже находят применение в биотехнологическом
производстве для проведения микробиологических исследований.
Также, немаловажную роль в исследовании микроорганизмов играют
кислотно-основные индикаторы, которые применяются в качестве добавки к
питательной среде с целью определения значений рН образующихся13
продуктов метаболизма, однако, исследование оптических свойств
индикаторов в контексте определения жизненной активности
микроорганизмов ранее не проводилось. В связи с этим, научная новизна
работы заключается в применении спектроскопических методов анализа для
определения жизненной активности микроорганизмов по изменению
оптических свойств ряда кислотно-основных индикаторов за счет выработки
определенных продуктов метаболизма.
Исследованы оптические свойства ряда кислотно-основных
индикаторов (бромкрезоловый зеленый, метил-тимоловый синий,
бромкрезоловый красный) флуориметрическим и фотометрическим
методами. Установлено, что бромкрезоловый зеленый и метилтимоловый
синий при взаимодействии с лактобактериями дают сигнал аналогичный
сигналу чистых растворов индикаторов, однако, при взаимодействии
индикатора бромкрезолового красного с лактобактериям наблюдается
появление нового сигнала в области 590 нм. Определено, что сигнал в
области 590 нм соответствует поведению индикатора в щелочной среде.
Определена рабочая концентрация индикатора, при которой возможно
проводить исследование жизненной активности лактобактерий – 5*10-4
моль/л. Показано, что при последовательном добавлении суспензии
лактобактерий к раствору индикатора наблюдается рост сигнала
пропорционально добавке микроорганизмов.
Проведено исследование влияния колибактерий на оптические
свойства индикатора бромкрезолового красного методом фотометрии. Было
показано, что добавление суспензии колибактерий к раствору индикатора
приводит к появлению двух сигналов: при 430 и 590 нм. Установлено, что
сигнал при 430 нм появляется в случае присутствия в растворе продуктов,
имеющих кислую среду, а сигнал при 590 нм появляется в случае
присутствия продуктов, имеющих щелочную среду.
Проведено исследование влияния колибактерий на изменение
оптических свойств индикатора бромкрезолового красного в зависимости от
времени культивирования микроорганизмов. Установлено, что с течением
времени культивирования при добавлении суспензии колибактерий к
раствору индикатора происходит изменение интенсивности пропускания в
областях 430 и 590 нм, что свидетельствует об активной выработке
бактериями продуктов метаболизма и их высокой жизненной активности.
Показано, что изменение интенсивности пропускания носит динамический108
характер с периодическим уменьшением сигнала сначала при длине волны
430 нм, а затем при 590 нм. Данный факт объясняется выработкой в процессе
метаболизма различных продуктов для поддержания оптимального значения
рН культуральной среды.
Для доказательства жизненной активности бактерий был применен
способ сканирования по регистрации флуоресценции при длине волны
возбуждения 360 нм, что соответствует возбуждению флуоресценции
внутриклеточного метаболита NADH, являющегося маркером жизненной
активности бактериальных клеток. Установлено, что интенсивность
флуоресцентного сигнала в области, соответствующей флуоресценции
внутриклеточного метаболита NADH, увеличивается по истечению времени
анализа, что связано с высокой жизненной активностью колибактерий.
Проведено исследование добавления глюкозы в культуральную среду
в качестве питательного субстрата. Определено, что добавление в суспензию
колибактерий глюкозы активизирует жизнедеятельность микроорганизмов,
что подтверждается увеличением интенсивности флуоресценции
внутриклеточного кофермента NADH в течение выбранного времени анализа
– 5 суток, по сравнению с суспензией без добавления глюкозы.
В результате выполненной работы показана возможность применения
флуориметрического и фотометрического методов анализа для определения
жизненной активности пробиотических микроорганизмов, таких как лакто- и
колибактерий, по изменению оптических свойств кислотно-основного
индикатора бромкрезолового красного. Данный подход позволит сократить
время анализа жизненной активности культивируемых микроорганизмов, а
также определить значение рН культуральной жидкости в процессе
культивирования, что позволит сделать вывод о продуктах, выделяемых в
процессе метаболизма, а также, в случае необходимости, скорректировать
технологические параметры культивир
индикаторов (бромкрезоловый зеленый, метил-тимоловый синий,
бромкрезоловый красный) флуориметрическим и фотометрическим
методами. Установлено, что бромкрезоловый зеленый и метилтимоловый
синий при взаимодействии с лактобактериями дают сигнал аналогичный
сигналу чистых растворов индикаторов, однако, при взаимодействии
индикатора бромкрезолового красного с лактобактериям наблюдается
появление нового сигнала в области 590 нм. Определено, что сигнал в
области 590 нм соответствует поведению индикатора в щелочной среде.
Определена рабочая концентрация индикатора, при которой возможно
проводить исследование жизненной активности лактобактерий – 5*10-4
моль/л. Показано, что при последовательном добавлении суспензии
лактобактерий к раствору индикатора наблюдается рост сигнала
пропорционально добавке микроорганизмов.
Проведено исследование влияния колибактерий на оптические
свойства индикатора бромкрезолового красного методом фотометрии. Было
показано, что добавление суспензии колибактерий к раствору индикатора
приводит к появлению двух сигналов: при 430 и 590 нм. Установлено, что
сигнал при 430 нм появляется в случае присутствия в растворе продуктов,
имеющих кислую среду, а сигнал при 590 нм появляется в случае
присутствия продуктов, имеющих щелочную среду.
Проведено исследование влияния колибактерий на изменение
оптических свойств индикатора бромкрезолового красного в зависимости от
времени культивирования микроорганизмов. Установлено, что с течением
времени культивирования при добавлении суспензии колибактерий к
раствору индикатора происходит изменение интенсивности пропускания в
областях 430 и 590 нм, что свидетельствует об активной выработке
бактериями продуктов метаболизма и их высокой жизненной активности.
Показано, что изменение интенсивности пропускания носит динамический108
характер с периодическим уменьшением сигнала сначала при длине волны
430 нм, а затем при 590 нм. Данный факт объясняется выработкой в процессе
метаболизма различных продуктов для поддержания оптимального значения
рН культуральной среды.
Для доказательства жизненной активности бактерий был применен
способ сканирования по регистрации флуоресценции при длине волны
возбуждения 360 нм, что соответствует возбуждению флуоресценции
внутриклеточного метаболита NADH, являющегося маркером жизненной
активности бактериальных клеток. Установлено, что интенсивность
флуоресцентного сигнала в области, соответствующей флуоресценции
внутриклеточного метаболита NADH, увеличивается по истечению времени
анализа, что связано с высокой жизненной активностью колибактерий.
Проведено исследование добавления глюкозы в культуральную среду
в качестве питательного субстрата. Определено, что добавление в суспензию
колибактерий глюкозы активизирует жизнедеятельность микроорганизмов,
что подтверждается увеличением интенсивности флуоресценции
внутриклеточного кофермента NADH в течение выбранного времени анализа
– 5 суток, по сравнению с суспензией без добавления глюкозы.
В результате выполненной работы показана возможность применения
флуориметрического и фотометрического методов анализа для определения
жизненной активности пробиотических микроорганизмов, таких как лакто- и
колибактерий, по изменению оптических свойств кислотно-основного
индикатора бромкрезолового красного. Данный подход позволит сократить
время анализа жизненной активности культивируемых микроорганизмов, а
также определить значение рН культуральной жидкости в процессе
культивирования, что позволит сделать вывод о продуктах, выделяемых в
процессе метаболизма, а также, в случае необходимости, скорректировать
технологические параметры культивир