Применение медицинского биотехнологического метода ВЕСТЕРН БЛОТТИНГА для идентификации белков и их использования для изучения патогенетических аспектов злокачественных новообразований
ВВЕДЕНИЕ 14
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
1.1 Факторы риска развития рака эндометрия 17
1.2 Инсулинорезистентность как один из важнейших патогенетических
моментов метаболического синдрома 21
1.3 Инсулиноподобные факторы роста и рак эндометрия 28
1.4 Вестерн-блоттинг 32
1.4.1 Подготовка образца 33
1.4.2 Гель-электро форез 33
1.4.3 Перенос на мембрану 34
1.4.4 Блокирование 37
1.4.5 Детекция 37
1.4.6 Анализ 39
1.4.7 Колориметрическая детекция 40
1.4.8 Хемилюминесцентная детекция 40
1.4.9 Радиоактивная детекция 40
1.4.10 Флюоресцентная детекция 41
1.4.11 Система оптимизации вестерн-блоттинга 41
2 ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 43
2.1 Клиническая характеристика больных 43
2.2 Методы исследования 43
2.2.1 Получение супернатантов тканей для Вестерн блоттинг анализа 44
2.2.2 Определение содержания белка в образце по методу Лоури 44
2.2.3 Электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лемли 45
2.2.4 Электроблоттинг - перенос белков на мембрану 46
2.2.5 Проведение и регистрация вестерн-блот гибридизации 46
2.2.6 Методы статистической обработки результатов исследования 47
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОВЕДЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ 48
4 ФИНАНСОВЫЙ МЕНЕДЖМЕНТ, РЕСУРСОЭФФЕКТИВНОСТЬ И
РЕСУРСОСБЕРЕЖЕНИЕ 53
4.1 Предпроектный анализ 53
4.1.1 Потенциальные потребители результатов исследования 53
4.1.2 SWOT-анализ 54
4.2 Планирование работ по НТИ 56
4.3 Определение трудоемкости выполнения работ 58
4.4 Разработка графика проведения научного исследования 59
4.5 Календарный план-график выполнения дипломной работы 62
4.6 Бюджет научно-технического исследования (НТИ) 67
4.6.1 Расчет материальных затрат НТИ 67
4.6.2 Расчет затрат на оборудование для научно-экспериментальных
работ 68
4.6.3 Основная заработная плата исполнителей темы 71
4.6.4 Дополнительная заработная плата исполнителей темы 73
4.6.5 Отчисления во внебюджетные фонды (страховые отчисления) 73
4.6.6 Накладные расходы 74
4.6.7 Формирование бюджета затрат научно-исследовательского проекта 75
4.7 Определение экономической эффективности исследования 76
4.7.1 Оценка сравнительной эффективности исследования 76
Актуальность
В работе методом ВЕСТЕРН БЛОТТА планируется идентифицировать в ткани аденокарцином эндометрия белок, связывающий инсулиноподобные факторы роста 6 (IGFBP-6). Выявление различных молекулярных механизмов опухолевой прогрессии является одним из перспективных подходов для улучшения прогноза при данной локализации. Только привлечение высокотехнологичных методов оценки белковой экспрессии (Вестерн блоттинг) позволяет решить данную проблему.
Известно, достаточно большое количество клеточных процессов и молекулярных механизмов вовлечено в развитие рака. Среди наиболее важных механизмов обсуждается роль системы инсулиноподобных факторов роста (ИФР-система), включающая инсулиноподобные факторы роста (IGF-I, IGF-II), шесть связывающих инсулиноподобные факторы роста белков (IGFBPs) и тирозинкиназный рецептор IGF-IR. Известно, что IGF-I и IGF-II стимулируют пролиферацию, клеточную подвижность, дифференциацию и выживаемость во многих типах опухолевых клеток. Обсуждается роль белков системы IGFs в таких сложных процессах как опухолевая инвазия и метастазирование. Известно, что IGF-II для ряда злокачественных опухолей действует как аутокринный фактор роста, повышенная экспрессия IGF-II по сравнению с нетрансформированной тканью выявлена во многих солидных опухолях, экспрессия IGF-II выявлялась чаще во многих злокачественных новообразованиях, чем IGF-I и уровень экспрессии IGF-II был значительно выше. В настоящее время IGFBP-6 позиционируется как уникальный среди других IGFBPs белок, имеющий в 20-100 раз более высокую аффинность к IGF- II, чем к IGF-I. Кроме того, у этого белка выявлены IGFs-независимые эффекты, такие как ингибирование неоангиогенеза, но с другой стороны, активация клеточной миграции. На экспериментальной модели колоректального рака было показано, что сниженная продукция IGFBP-6 ассоциировалась с активацией клеточной пролиферации. Возникновение и прогрессирование колоректального рака и рака эндометрия часто происходит на фоне метаболического синдрома. На основании данных литературы можно предположить, что наряду с некоторыми перспективными внутриклеточными мишенями-белками исследование внеклеточных IGFBPs, и в том числе IGFBP- 6, достаточно перспективно в плане выявления возможных взаимосвязей адипокин-опосредованных (через адипокины - основные гормоны жировой ткани) и IGF-IR-опосредованных сигнальных путей, вовлеченных в важнейших процессы канцерогенеза.
Данное исследование будет выполнено в рамках международного Гранта РФФИ (грант № 14-04-91150 ГФЕН_а) «Фундаментальные аспекты участия системы инсулиноподобных факторов роста в развитии злокачественных новообразований, ассоциированных с метаболическим синдромом”. Исследование имеет определенное практическое значение для отработки биотехнологических методов исследований для изучения аспектов патогенеза рака и поиска возможных новых факторов прогноза рака на фоне метаболического синдрома.
Научная новизна: впервые изучена экспрессия экспрессия белка IGFBP-6 в злокачественных новообразованиях, ассоциированных с метаболическим синдромом.
Практическая значимость работы обусловлена полученными данными о связи экспрессии IGFBP-6 с наличием метаболического синдрома, позволит в будущем планировать профилактические мероприятия для больных данных локализаций, ассоциированных с метаболическим синдромом.
Цель исследования: изучение ассоциированных с системой инсулиноподобных факторов роста патогенетических аспектов злокачественных новообразований взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами и уровнем рецепторов адипонектина.
Задачи:
1. Изучение биотехнологического метода вестерн блоттинг;
2. Изучить белковую экспрессию IGFBP-6 в ткани рака методом Вестерн блоттинг;
3. Сопоставить данные по белковой экспрессии IGFBP-6 с клиническими параметрами и уровнем рецепторов адипонектина;
4. Расчет ресурсоэффективности и ресурсосбережения;
5. Оценка производственной и экологической безопасности проекта.
