1. ВВЕДЕНИЕ 12
1.1. Актуальность темы. Основные современные представления о холинергической
регуляции миокарда 12
1.2. Задачи исследования 15
1.3. Научная новизна исследования 16
1.4. Научно-практическая значимость 17
1.5. Основные положения, выносимые на защиту 18
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 21
2.1. Парасимпатическая иннервация сердца 21
2.1.2. Внутрисердечное нервное сплетение 24
2.1.3. Структура вегетативных синапсов в сердечной ткани 30
2.2. Жизненный цикл АХ 33
2.2.1. Синтез АХ в нейронах 33
2.2.2. Синтез АХ в мышечных клетках 35
2.2.3. Квантовая секреция АХ 36
2.2.4. Распад АХ. Ацетилхолинэстераза 39
2.2.5. Обратный захват холина. Система захвата холина высокого сродства 41
2.3. Неквантовая секреция АХ 43
2.3.1. Открытие неквантовой секреции АХ 43
2.3.2. Механизм неквантового выделения АХ 44
2.3.3. Неквантовая секреция АХ в нейронах, иннервирующих гладкие мышцы
дыхательных путей 46
2.3.4. Неквантовая секреция АХ в сенсорных нейронах позвоночных и
беспозвоночных 47
2.3.5. Регуляция неквантовой секреции АХ 48
2.3.6. Гипотезы о физиологической роли феномена неквантовой секреции АХ 54
2.4. Реализация холинергических эффектов в сердце 55
2.4.1. Общая характеристика мускариновых рецепторов 56
2.4.2. Мускариновые рецепторы в сердце 58
2.4.3. М2-рецепторы в сердце 60
2.4.4. М3-рецепторы в сердце млекопитающих 65
2.5. Особенности холинергичекой стимуляции при возникновении патологических
состояний в сердце 72
2.5.1. Ишемическое повреждение миокарда и М3-рецепторы 73
2.5.2. Патологическая гипертрофия сердца и М3-рецепторы 74
2.5.3. Аритмия и мускариновые рецепторы 75
2.5.4. Сердечная недостаточность и М3-рецепторы 76
2.6. Особенности холинергической регуляции миокарда у низших позвоночных 77
2.7. Развитие холинегической регуляции в ходе онтогенеза 82
3. МЕТОДИКА 86
3.1. Животные 87
3.1.1. Взрослые млекопитающие 87
3.1.2. Получение крысят и 19-дневных крысиных эмбрионов 87
3.1.3. Хроническая десимпатизация крыс 88
3.1.4. Рыбы и амфибии 88
3.2. Внутриклеточная регистрация электрической активности 89
3.2.1. Получение препаратов миокарда млекопитающих 89
3.2.2. Внутриклеточная регистрация ПД 91
3.2.3. Ход эксперимента 92
3.2.4. Обработка препаратов миокарда ботулиническим токсином 93
3.2.5. Обработка результатов 93
3.3. Метод пэтч-кламп 94
3.3.1. Выделение изолированных кардиомиоцитов крысы 94
3.3.2. Регистрация кальциевого тока Ь-типа в изолированных кардиомиоцитах
методом пэтч-кламп 95
3.3.3. Регистрация калиевых токов в изолированных кардиомиоцитах методом
пэтч-кламп 96
3.3.4. Обработка результатов 97
3.4. Оценка динамики эндоцитоза и экзоцитоза в предсердных препаратах с помощью
флуоресцентной метки БМ1-43 97
3.5. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов миокарда 98
3.5.1. Использованные антитела 99
3.5.2. Протокол окраски 99
3.6. Определение общего количества мускариновых рецепторов с помощью
специфических антител 100
3.7. Молекулярно-биологические исследования уровня экспрессии генов методом
полимеразной цепной реакции в реальном времени 101
3.7.1. Выделение тотальной РНК из препаратов сердечной мышцы 101
3.7.2. Обработка ДНКазой I 102
3.7.3. Обратная транскрипция 103
3.7.4. Выделение геномной ДНК 104
3.7.5. Праймеры, использованные в работе 105
3.7.6. Полимеразная цепная реакция 106
3.8. Использованные в работе физиологически активные вещества 107
4. РЕЗУЛЬТАТЫ 109
4.1. Неквантовый способ секреции АХ в миокарде, выяснение его механизма и
способов регуляции 110
4.1.1. Доказательство существования неквантовой секреции АХ в миокарде
млекопитающих 110
4.1.2. Свидетельства широкого распространения феномена неквантовой секреции
АХ в миокарде среди позвоночных животных 134
4.1.3. Выяснение механизма неквантовой секреции в миокарде на примере
предсердного миокарда крысы 141
4.1.4. Регуляция неквантовой секреции АХ различными кардиотропными
сигнальными соединениями 151
4.2. Исследование рецепторных механизмов холинергической регуляции сердца. ...163
4.2.1. Молекулярно-биологические доказательства наличия М3-рецепторов в
миокарде млекопитающих 163
4.2.2. Электрофизиологические эффекты стимуляции М3-холинорецепторов в
миокарде млекопитающих 169
4.2.3. Молекулярные механизмы электрофизиологических эффектов стимуляции
М3-рецепторов 177
4.3. Изучение особенностей механизмов холинергической регуляции миокарда на
ранних стадиях онтогенеза 187
4.3.1. Особенности электрической активности предсердного и желудочкового
миокарда крыс на ранних стадиях онтогенеза 188
4.3.2. Доказательство наличия неквантовой секреции АХ в миокарде крыс на
ранних стадиях онтогенеза 192
4.3.3. Выявление уровня экспрессии генов М2 и М3-холинорецепторов в
желудочковом и предсердном миокарде крыс на ранних стадиях онтогенеза 196
4.3.4. Исследование электрофизиологических эффектов стимуляции М2 и М3-
холинорецепторов в желудочковом и предсердном миокарде крыс на ранних стадиях онтогенеза 198
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 203
5.1. Доказательство существования неквантовой секреции АХ в миокарде 203
5.2. Механизм неквантовой секреции АХ 206
5.3. Регуляция неквантовой секреции АХ в миокарде 207
5.4. Наличие функционально активных М3-холинорецепторов в миокарде крысы и мыши 209
5.5. Новый молекулярный механизм электрофизиологических эффектов стимуляции
М3 -рецепторов 210
5.6. Становление холинергической регуляции миокарда в процессе онтогенеза 212
5.7. Ограничения и возможные недостатки проведенного исследования 214
5.8. Перспективы дальнейших исследований 216
6. ВЫВОДЫ 219
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
В настоящее время интенсивно развивается исследование механизмов регуляции деятельности сердца. В первую очередь это обусловлено высокой социальной значимостью сердечно-сосудистых заболеваний. Среди всего многообразия регуляторных воздействий, которым сердце подвергается в организме, парасимпатическая регуляция является, пожалуй, одним из наиболее сложно организованных и важных для его нормального функционирования в соответствие с потребностями организма. Поэтому не удивительно, что механизмы парасимпатической регуляции сердца вызывали большой интерес у физиологов начиная с открытия в 1845 году братьями Вебер эффекта замедления сердечного ритма при раздражении продолговатого мозга у лягушки, исчезавшего после перерезки вагосимпатического ствола. В 1921 году Отто Леви доказал возможность передачи сигнала от нерва к эффекторному органу в знаменитом эксперименте с перфузией сердца лягушки раствором с добавлением перфузата, вытекающего из сердца второй лягушки. При стимуляции вагосимпатического ствола у второй лягушки ритм сокращений замедлялся не только у ее сердца, но и у сердца первой лягушки. «Вагусная субстанция», вызывающая отрицательный хронотропный эффект, через некоторое время была идентифицирована как ацетилхолин (АХ).
Сейчас АХ широко известен как основное, хотя и не единственное, сигнальное соединение парасимпатической нервной системы, воздействующее на миокард. Несмотря на то, что в течение прошлого века адренергические механизмы регуляции миокарда удостоились существенно большего внимания физиологов и врачей, к концу столетия сложилась достаточно целостная картина холинергической регуляции сердца. Более того, стали накапливаться факты, прямо указывающие на важнейшую защитную роль холинергических влияний, в частности при ишемическом повреждении. Например, в модели экспериментального инфаркта миокарда, вызванного окклюзией коронарной артерии у кошки, было показано, что как блокирование ацетилхолиновых рецепторов атропином, так и нарушение дальнейшего проведения сигнала в кардиомиоцитах посредством коклюшного токсина, многократно увеличивает вероятность возникновения фибрилляции желудочков [Rosenshtraukh с1 Д1., 1994]. В последние годы усиление естественного кардиопротекторного влияния АХ при помощи мягких ингибиторов
ацетилхолинэстеразы (АХЭ), разрушающей АХ в сердечной ткани, предлагается в качестве нового подхода в терапии постинфарктных состояний [Castro et al, 2004; Zimerman et al, 2010], в дополнение к широко используемым адреноблокаторам. Таким образом, глубокое исследование механизмов холинергической регуляции миокарда является крайне важной задачей для современной физиологии.
1. Помимо секреции, обусловленной экзоцитозом синаптических везикул, АХ постоянно выделяется неквантовым путем из окончаний интрамуральных парасимпатических постганглионарных нейронов в миокарде позвоночных животных (млекопитающих, рыб и амфибий).
2. Неквантовая секреция АХ в сердце реализуется посредством транспортера обратного захвата холина высокого сродства.
3. Оксид азота ингибирует неквантовую секрецию АХ в миокарде, в то время как АТФ, модулирующий данный процесс в нервно-мышечном синапсе, не действует на неквантовую секрецию в сердце.
4. Норадреналин подавляет неквантовую секрецию АХ в миокарде крыс посредством активации щ- и а2-адренорецепторов.
5. В предсердном и желудочковом миокарде крысы и мыши, а также в синоатриальном узле сердца мыши экспрессируются гены как М2, так и МЗ-холинорецепторов, при этом с помощью селективных антител обнаруживаются белковые молекулы М2 и МЗ- рецепторов.
6. Стимуляция МЗ-холинорецепторов приводит к уменьшению длительности ПД в предсердном и желудочковом миокарде крысы, а также к замедлению автоматической активности в синоатриальном узле мыши.
7. Электрофизиологические эффекты стимуляции М3-рецепторов в миокарде крысы в значительной степени опосредуются активацией фосфоинозитольного сигнального каскада и протеинкиназы С.
8. Действие М3-стимуляции на электрическую активность в миокарде крысы обусловлено уменьшением кальциевого тока Ь-типа и не связано с изменением каких- либо калиевых токов.
9. Неквантовое выделение АХ выражено в миокарде не только взрослых животных, но и на ранних стадиях постнатального онтогенеза, а также в конце пренатального онтогенеза, на 19 день внутриутробного развития, когда квантовая секреция еще неактивна.
10. Действие стимуляции М3-рецепторов в желудочковом миокарде в конце пренатального онтогенеза и у новорожденных крысят выражено многократно сильнее, чем у взрослых животных. Это различие обусловлено более выраженной экспрессией гена М3-рецепторов. В предсердном миокарде таких изменений функционального значения М3-рецепторов в ходе онтогенеза не происходит.
Помощь студентам и аспирантам в выполнении работ от наших партнеров
