Введение 12
1. Определение состава микробиотического сообщества в 14
различном биологическом материале больных ХОБЛ (Обзор литературы)
1.1. Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) 14
1.2. Микробиотическое сообщество и его основные 17 представители
1.3. Методы изучения микробиотического сообщества 19
1.4. Методы выделения бактериальной ДНК из биологических 27
материалов
2. Объект и методы исследования 35
2.1. Объект исследования 35
2.2. Методы исследования 36
2.3. Методика качественной оценки выделенной ДНК 43
3. Результаты проведенного исследования 45
3.1. Результаты по подбору методов пробоподготовки мокроты 45
для выделения ДНК
3.2. Оценка качества выделенной ДНК 46
3.3. Получение информации о видовом составе микробиоты 48
образцов мокроты и орофарингеальных мазков
3.4. Характеристика таксономического состава образцов 48
мокроты
3.5. Характеристика таксономического состава образцов 49
орофарингеальных мазков
4. Финансовый менеджмент, ресурсоэффективность и 53
ресурсосбережение
4.1. Инициация научного исследования 53
4.2. Планирование научного исследования 57
4.3. Бюджет научного исследования 67
4.4. Определение ресурсной (ресурсоберегающей), 74 экономической эффективности исследования
Организм человека представляет сложную систему, симбиотически взаимодействующую населяющими его микроорганизмами, в совокупности именуемыми микробиотой. Микробиота - сообщество микроорганизмов, которые населяют различные органы и системы, одним из которых являются дыхательные пути. Популяции микроорганизмов играют важную роль в поддержании организма человека, в том числе участвуя в пищеварении, регуляции иммунитета, защите от патогенов и т.д. Изменения ее качественного и количественного состава приводят к различным заболеваниям органов дыхания, включая хронические обструктивные заболевания легких. В настоящее время роль микробиотических сообществ дыхательных путей в развитии и прогрессировании бронхообструктивных заболеваний остается неопределенной. Поэтому изучение состава сообщества микроорганизмов человека является необходимым шагом для оценки роли микроорганизмов в развитии болезней легких.
Первым шагом в изучении сообществ микроорганизмов является определение их видового состава. На данный момент наиболее используемыми методами изучения микробного сообщества являются культуральный метод и современные методы, основанные на сравнении нуклеотидной последовательности, т.е. секвенирование образцов. Каждый из перечисленных методов имеет свои недостатки и достоинства. Выбор того или иного метода основан прежде всего на таких характеристиках, как стоимость, продолжительность и трудоемкость анализа.
С помощью культуральных методов возможно выявить только 1-10% бактерий, кроме того культивирование является длительным процессом. Разработка новых молекулярных методов количественного анализа и секвенирования привела к появлению новых подходов и преодолению ограничений культуральных методов. Использование технологии высокопроизводительного секвенирования может дать более полную оценку состава, а соответственно, и роли микробиотического сообщества в патогенезе хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).
В настоящее время есть данные о том, что метод выделения может вносить существенный вклад в представленность микроорганизмов при использовании технологии высокопроизводительного секвенирования. Различные типы биологического материала содержат собственный набор примесей (ингибиторов), которые могут оставаться после выделения в образце ДНК и негативно влиять на последующие этапы секвенирования. Поэтому для каждого типа образцов необходимо разрабатывать специальные методы пробоподготовки для выделения ДНК.
Целью данной работы было выбрать метод пробоподготовки образцов макроты и орофарингиальных мазков для выделения ДНК, предназначенной для определения таксономического состава в образцах с использованием технологии секвенирования нового поколения.
Задачи исследования
1. Создать коллекцию биологического материала: мокрота и орофарингеальные мазки больных ХОБЛ.
2. Выбрать оптимальный метод пробоподготовки для выделения ДНК из образцов мокроты, полученных от больных ХОБЛ.
3. Провести выделение ДНК из образцов мокроты и орофаренгиальных мазков больных ХОБЛ и определить состав микробиотического сообщества с использованием технологии высокопроизводительного секвенирования.
Методы исследования
1. Пробоподготовка образцов биоматериала (мокрота)
2. Выделение ДНК
3. Электрофорез ДНК в агарозном геле
4. Секвенирование на приборе Miseq Illumina.
5. Биоинформационный анализ и статистическая обработка данных
Научная новизна исследования.
1. Разработана и оптимизирована методика выделения ДНК из мокроты, больных ХОБЛ.
2. Проанализирован состав микробиоты орофоренгиального мазка и мокроты у больных ХОБЛ сибирского региона.
Практическая значимость.
Разработанная методика по выделению ДНК из мокроты может быть внедрена и использована в клинической практике для идентификации состава микробиотического сообщества мокроты с использованием молекулярно-генетических методов.
Апробация работы
Результаты данного исследования были представлены на Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Химия и химическая технология в XXI веке» имени профессора Л.П. Кулёва, посвященной 120-летию Томского политехнического университета.
