РАЗРАБОТКА ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ ИММУНОСЕНСОРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI И STAPHYLOCOCCUS AUREUS С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАНОЧАСТИЦ Fe3O4 В КАЧЕСТВЕ ПРЯМОЙ СИГНАЛООБРАЗУЮЩЕЙ МЕТКИ
|
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
МЕТОДОЛОГИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ
МЕТОДОЛОГИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ
Актуальность
В настоящее время в связи с повсеместным загрязнением объектов окружающей среды, ослаблением производственного контроля качества питьевой воды и продуктов питания, а также снижением иммунитета у населения, имеет место стремительное распространение возбудителей инфекционных заболеваний бактериальной этиологии. Наиболее распространенным возбудителем инфекционных заболеваний бактериальной этиологии являются бактерии группы кишечной палочки Escherichia coli.Являясь грамотрицательным патогеном, бактерии E. coliв норме населяют нижнюю часть кишечника теплокровных животных и человека. Однако, некоторые штаммы E. coli способны вызывать самые различные заболевания, включая тяжелые пищевые отравления, перитонит, кольпит и сепсис. Грамположительные бактерии Staphylococcus aureusотносятся к возбудителям множества кожных и инфекционно-токсических заболеваний. Ключевыми факторами в борьбе с бактериальными патогенами являются быстрое и точное обнаружение источника инфицирования и контроль распространения бактериальных агентов в окружающей среде.
В современной клинической и лабораторной диагностике используют методы бактериального посева с подсчетом колоний, иммуноферментного анализа и ДНК- анализа для идентификации патогена и определения степени обсемененности анализируемой пробы. Несмотря на широкое распространение, данные методы имеют ряд существенных недостатков. В частности, метод бактериального посева требует значительных временных затрат (2-3 дня) и позволяет определить содержание бактерий в пробе с точностью одного порядка (10 или 100 КОЕ/мл). Методы иммуноферментного анализа и ПЦР являются более экспрессными и точными, однако проведение процедуры определения патогенов требует поддержания специализированных (стерильных) условий, наличия сложного и дорогого оборудования, а также специалистов высокой квалификации. Кроме того, велика вероятность получения ложноположительных или ложноотрицательных результатов, поскольку данные методы не позволяют оценить жизнеспособность определяемых патогенов.
Таким образом, актуальной задачей является разработка новых экспрессных, чувствительных, точных, недорогих и удобных в использовании методов, сенсоров и приборов для определения возбудителей инфекционных заболеваний в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и биологических жидкостях пациентов.
Степень разработанности темы исследования
Разработка высокочувствительных, точных и недорогих биосенсоров, позволяющих быстро обнаружить инфекционные агенты в различных объектах, является актуальным научным направлением. Сочетание простоты, экспрессности и точности обнаружения патогенов с невысокой стоимостью сенсора представляет сложную задачу, одним из путей решения которой является применение сигналообразующей метки, способной быстро и точно генерировать аналитический сигнал в зависимости от количества аналита в исследуемой пробе. Применение в качестве сигналообразующих меток наноматериалов различной природы, в том числе обладающих магнитными свойствами, также является перспективным направлением развития иммуносенсоров, поскольку позволяет избежать использования дорогих и нестабильных при хранении ферментов.
Одним из наиболее перспективных направлений является разработка электрохимических иммуносенсоров с использованием в качестве сигналообразующей метки наноматериалов на основе магнетита. Уникальное сочетание специфичности иммунореакции, магнитных свойств наночастиц и детектирования отклика от метки электрохимическими методами анализа позволит существенно снизить предел обнаружения, увеличить точность определения патогенов, а также снизить себестоимость и временные затраты на проведение анализа.
Цель работы: разработка бесферментных электрохимических иммуносенсоров для количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 с использованием в качестве метки наночастиц магнетита.
Достижение поставленной цели требует решения ряда задач:
•Исследовать строение, состав и морфологические особенности синтезированных методом соосаждения наночастиц состава «1;е3О4-хитозан» и «Ее3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан».
•Изучить характер электропревращений наночастиц Fe3O4в апротонной среде.
•Изучить влияние модифицирующего покрытия на седиментационную устойчивость и электрохимические свойства наночастиц Fe3O4.
•Осуществить выбор оптимальных условий формирования аналитического сигнала от наночастиц магнетита в апротонной среде.
•Исследовать кинетические особенности взаимодействия наночастиц «Fe3O4- хитозан» и «Бе3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан» с клетками Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266
•Осуществить выбор рабочего электрода и оптимального способа модифицирования его поверхности антителами
•Осуществить выбор оптимальных условий формирования иммунокомплекса «антитело-меченая наночастицами бактерия» на поверхности рабочего электрода
•Осуществить разработку алгоритмов проведения процедуры анализа для количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266
•Провести анализ бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B- 1266 в модельных суспензиях и реальных пробах с использованием разработанного электрохимического иммуносенсора и референсных лабораторных методов (бактериального посева и ИФА).
Научная новизна работы:
1. Впервые исследованы особенности электрохимических превращений наночастиц Fe3O4в растворе ацетонитрила, используемых в качестве прямой сигналообразующей метки в разработанных электрохимических иммуносенсорах для количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266. Установлено, что характер окислительно-восстановительных превращений наночастиц магнетита на поверхности рабочего электрода в апротонной среде зависит от потенциала предварительного электролиза. Предложены схемы протекания электрохимических превращений наночастиц Fe3O4на поверхности рабочего электрода в апротонной среде после предварительного электролиза при потенциалах -2,5 В и -1,3 В. Выбраны условия формирования прямого электрохимического отклика от Fe3O4в апротонной среде для дальнейшего использования наночастиц в качестве метки в электрохимическом иммуноанализе.
2. Впервые установлено, что покрытие хитозаном и 3-аминопропилтриэтоксисиланом не влияет на электрохимическую активность наночастиц магнетита в апротонной среде. Обоснована возможность использования наночастиц «Fe3O4-хитозан» и «Fe3O4-3-аминопропилтриэтоксисилан» в качестве прямой сигналообразующей метки для количественного определения бактерий.
3. Показано, что наночастицы Ре3О4, модифицированные хитозаном и 3-аминопропилтриэтоксисиланом, проявляют большую седиментационную устойчивость по сравнению с немодифицированными наночастицами. Изучена кинетика процессов взаимодействия наночастиц «Ре3О4-хитозан» и «Ре3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан» с бактериальными клетками Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266.
4. Установлена линейная зависимость величины прямого аналитического сигнала наночастиц магнетита, включенных в иммунокомплекс на поверхности рабочего электрода, от количества бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266 в модельных суспензиях.
5. Впервые определены чувствительность, точность и селективность разработанных электрохимических иммуносенсоров для детектирования бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266 в сравнении с методами бактериального посева и ИФА на модельных суспензиях, смесях бактерий и реальных пробах.
Практическая значимость работы:
1. Синтезированы наночастицы «Ре3О4-хитозан» и «Ре3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан», проявляющие выраженную электрохимическую активность в апротонной среде, для количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266. Определены размеры, форма и состав синтезированного материала.
2. Разработаны простые, экспрессные и точные бесферментные электрохимические иммуносенсоры для определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266 с использованием в качестве метки наночастиц «Ре3О4-хитозан» и «Ре3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан» и детектированием прямого аналитического сигнала в апротонной среде.
3. Показана и обоснована возможность практического применения разработанных электрохимических иммуносенсоров с прямой детекцией аналитического сигнала от наночастиц Ре3О4 для селективного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266 в модельных суспензиях и реальных объектах.
Положения, выносимые на защиту:
1. Результаты исследований размеров, формы, состава и морфологии наночастиц «Ре3ОД-хитозан» и «Ре3ОД-3-аминопропилтриэтоксисилан», полученные методами электронной микроскопии и ИК-спектроскопии.
2. Результаты исследования характера электрохимических превращений наночастиц магнетита в апротонной среде.
3. Результаты исследования кинетики взаимодействия наночастиц «Ре3ОД- хитозан» и «Ре3ОД-3-аминопропилтриэтоксисилан» с бактериальными клетками Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266.
Д. Бесферментные электрохимические иммуносенсоры для определения содержания бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266.
5. Результаты количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC
25992 и Staphylococcus aureus B-1266 в модельных смесях и реальных пробах, полученные с использованием разработанных электрохимических иммуносенсоров и подтвержденные в независимой лаборатории методами бактериального посева и ИФА (исследования проведены на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск).
Степень достоверности и апробация работы
Достоверность полученных данных определяется использованием в работе современных физико-химических методов исследования и высокотехнологичного оборудования, а также статистической обработкой полученных результатов . Правильность определения бактерий подтверждена путем сравнения результатов детектирования Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 в модельных смесях и реальных пробах, полученных с использованием разработанных электрохимических иммуносенсоров и методами ИФА и бактериального посева (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск).
Результаты исследований, выполненных в рамках данной диссертационной работы, были представлены на всероссийских и международных конференциях: VIII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2012» (Уфа-Абзаково, 2012), всероссийской конференции «Химия и медицина» с молодежной научной школой (Уфа-Абзаково, 2013, 2015), втором съезде аналитиков России (Москва, 2013), конференции «Drug Analysis 2014» (Льеж, Бельгия, 2014), Уральском научном форуме «Современные проблемы органической химии» (Екатеринбург, 2014), конференции «Euroanalysis 2015» (Бордо, Франция, 2015), конференции «Химический анализ и медицина» (Москва, 2015), международной конференции «Recent advances in food analysis» (Прага, Чехия, 2015).
Диссертационная работа является частью исследований, проводимых на кафедре аналитической химии Химико-технологического института УрФУ имени Б. Н. Ельцина в рамках госбюджетной темы Н687.42Г.002/12, грантов РФФИ: 09-О3-12242-офи_м, 14¬03-01017, гранта для молодых ученых У.М.Н.И.К (тема №6 проект 0011038 2015 года).
Публикации. По результатам проведенных исследований опубликованы: 2 статьи в журналах, входящих в базы данных Scopus и Web of Science; получен 1 патент на изобретение; опубликовано 10 тезисов докладов на всероссийских и международных научных конференциях.
Личный вклад автора заключался постановке и проведении научных экспериментов, анализе и систематизации полученных результатов, а также в подготовке научных статей, опубликованных в соавторстве.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, и списка литературных источников (246 источников). Текст диссертационной работы изложен на 150 страницах компьютерной верстки, содержит 32 рисунка и 11 таблиц.
Во введении изложены основные положения об актуальности и степени разработанности темы диссертационной работы, определены цели и задачи исследования, сформулирована научная новизна и практическая значимость, а также положения, выносимые на защиту диссертации.
В первой главе приведены основные достижения в области разработки биосенсоров для определения бактериальных агентов. Особое внимание уделено иммуносенсорам, в которых в качестве метки использованы наноматериалы.
Во второй главе представлены сведения о реактивах, материалах, методологической и инструментальной базе диссертационного исследования.
Третья глава посвящена исследованию характера электропревращений наночастиц магнетита в апротонном растворе, оценке влияния факторов внешней среды на процессы формирования прямого электрохимического отклика от наночастиц и получению аналитического сигнала для дальнейшего использования в электрохимическом иммуноанализе. Обоснована возможность использования наночастиц магнетита в качестве прямой сигналообразующей метки в электрохимическом иммуноанализе.
Четвертая глава включает в себя результаты исследований процессов взаимодействия наночастиц магнетита с бактериальными клетками. Приведены результаты сравнительных испытаний чувствительности планарных платиновых электродов, модифицированных антителами тремя различными способами. Описаны результаты определения целевых бактерий в модельных суспензиях и реальных образцах.
В настоящее время в связи с повсеместным загрязнением объектов окружающей среды, ослаблением производственного контроля качества питьевой воды и продуктов питания, а также снижением иммунитета у населения, имеет место стремительное распространение возбудителей инфекционных заболеваний бактериальной этиологии. Наиболее распространенным возбудителем инфекционных заболеваний бактериальной этиологии являются бактерии группы кишечной палочки Escherichia coli.Являясь грамотрицательным патогеном, бактерии E. coliв норме населяют нижнюю часть кишечника теплокровных животных и человека. Однако, некоторые штаммы E. coli способны вызывать самые различные заболевания, включая тяжелые пищевые отравления, перитонит, кольпит и сепсис. Грамположительные бактерии Staphylococcus aureusотносятся к возбудителям множества кожных и инфекционно-токсических заболеваний. Ключевыми факторами в борьбе с бактериальными патогенами являются быстрое и точное обнаружение источника инфицирования и контроль распространения бактериальных агентов в окружающей среде.
В современной клинической и лабораторной диагностике используют методы бактериального посева с подсчетом колоний, иммуноферментного анализа и ДНК- анализа для идентификации патогена и определения степени обсемененности анализируемой пробы. Несмотря на широкое распространение, данные методы имеют ряд существенных недостатков. В частности, метод бактериального посева требует значительных временных затрат (2-3 дня) и позволяет определить содержание бактерий в пробе с точностью одного порядка (10 или 100 КОЕ/мл). Методы иммуноферментного анализа и ПЦР являются более экспрессными и точными, однако проведение процедуры определения патогенов требует поддержания специализированных (стерильных) условий, наличия сложного и дорогого оборудования, а также специалистов высокой квалификации. Кроме того, велика вероятность получения ложноположительных или ложноотрицательных результатов, поскольку данные методы не позволяют оценить жизнеспособность определяемых патогенов.
Таким образом, актуальной задачей является разработка новых экспрессных, чувствительных, точных, недорогих и удобных в использовании методов, сенсоров и приборов для определения возбудителей инфекционных заболеваний в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и биологических жидкостях пациентов.
Степень разработанности темы исследования
Разработка высокочувствительных, точных и недорогих биосенсоров, позволяющих быстро обнаружить инфекционные агенты в различных объектах, является актуальным научным направлением. Сочетание простоты, экспрессности и точности обнаружения патогенов с невысокой стоимостью сенсора представляет сложную задачу, одним из путей решения которой является применение сигналообразующей метки, способной быстро и точно генерировать аналитический сигнал в зависимости от количества аналита в исследуемой пробе. Применение в качестве сигналообразующих меток наноматериалов различной природы, в том числе обладающих магнитными свойствами, также является перспективным направлением развития иммуносенсоров, поскольку позволяет избежать использования дорогих и нестабильных при хранении ферментов.
Одним из наиболее перспективных направлений является разработка электрохимических иммуносенсоров с использованием в качестве сигналообразующей метки наноматериалов на основе магнетита. Уникальное сочетание специфичности иммунореакции, магнитных свойств наночастиц и детектирования отклика от метки электрохимическими методами анализа позволит существенно снизить предел обнаружения, увеличить точность определения патогенов, а также снизить себестоимость и временные затраты на проведение анализа.
Цель работы: разработка бесферментных электрохимических иммуносенсоров для количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 с использованием в качестве метки наночастиц магнетита.
Достижение поставленной цели требует решения ряда задач:
•Исследовать строение, состав и морфологические особенности синтезированных методом соосаждения наночастиц состава «1;е3О4-хитозан» и «Ее3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан».
•Изучить характер электропревращений наночастиц Fe3O4в апротонной среде.
•Изучить влияние модифицирующего покрытия на седиментационную устойчивость и электрохимические свойства наночастиц Fe3O4.
•Осуществить выбор оптимальных условий формирования аналитического сигнала от наночастиц магнетита в апротонной среде.
•Исследовать кинетические особенности взаимодействия наночастиц «Fe3O4- хитозан» и «Бе3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан» с клетками Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266
•Осуществить выбор рабочего электрода и оптимального способа модифицирования его поверхности антителами
•Осуществить выбор оптимальных условий формирования иммунокомплекса «антитело-меченая наночастицами бактерия» на поверхности рабочего электрода
•Осуществить разработку алгоритмов проведения процедуры анализа для количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266
•Провести анализ бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B- 1266 в модельных суспензиях и реальных пробах с использованием разработанного электрохимического иммуносенсора и референсных лабораторных методов (бактериального посева и ИФА).
Научная новизна работы:
1. Впервые исследованы особенности электрохимических превращений наночастиц Fe3O4в растворе ацетонитрила, используемых в качестве прямой сигналообразующей метки в разработанных электрохимических иммуносенсорах для количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266. Установлено, что характер окислительно-восстановительных превращений наночастиц магнетита на поверхности рабочего электрода в апротонной среде зависит от потенциала предварительного электролиза. Предложены схемы протекания электрохимических превращений наночастиц Fe3O4на поверхности рабочего электрода в апротонной среде после предварительного электролиза при потенциалах -2,5 В и -1,3 В. Выбраны условия формирования прямого электрохимического отклика от Fe3O4в апротонной среде для дальнейшего использования наночастиц в качестве метки в электрохимическом иммуноанализе.
2. Впервые установлено, что покрытие хитозаном и 3-аминопропилтриэтоксисиланом не влияет на электрохимическую активность наночастиц магнетита в апротонной среде. Обоснована возможность использования наночастиц «Fe3O4-хитозан» и «Fe3O4-3-аминопропилтриэтоксисилан» в качестве прямой сигналообразующей метки для количественного определения бактерий.
3. Показано, что наночастицы Ре3О4, модифицированные хитозаном и 3-аминопропилтриэтоксисиланом, проявляют большую седиментационную устойчивость по сравнению с немодифицированными наночастицами. Изучена кинетика процессов взаимодействия наночастиц «Ре3О4-хитозан» и «Ре3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан» с бактериальными клетками Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266.
4. Установлена линейная зависимость величины прямого аналитического сигнала наночастиц магнетита, включенных в иммунокомплекс на поверхности рабочего электрода, от количества бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266 в модельных суспензиях.
5. Впервые определены чувствительность, точность и селективность разработанных электрохимических иммуносенсоров для детектирования бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266 в сравнении с методами бактериального посева и ИФА на модельных суспензиях, смесях бактерий и реальных пробах.
Практическая значимость работы:
1. Синтезированы наночастицы «Ре3О4-хитозан» и «Ре3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан», проявляющие выраженную электрохимическую активность в апротонной среде, для количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266. Определены размеры, форма и состав синтезированного материала.
2. Разработаны простые, экспрессные и точные бесферментные электрохимические иммуносенсоры для определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266 с использованием в качестве метки наночастиц «Ре3О4-хитозан» и «Ре3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан» и детектированием прямого аналитического сигнала в апротонной среде.
3. Показана и обоснована возможность практического применения разработанных электрохимических иммуносенсоров с прямой детекцией аналитического сигнала от наночастиц Ре3О4 для селективного определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266 в модельных суспензиях и реальных объектах.
Положения, выносимые на защиту:
1. Результаты исследований размеров, формы, состава и морфологии наночастиц «Ре3ОД-хитозан» и «Ре3ОД-3-аминопропилтриэтоксисилан», полученные методами электронной микроскопии и ИК-спектроскопии.
2. Результаты исследования характера электрохимических превращений наночастиц магнетита в апротонной среде.
3. Результаты исследования кинетики взаимодействия наночастиц «Ре3ОД- хитозан» и «Ре3ОД-3-аминопропилтриэтоксисилан» с бактериальными клетками Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureusВ-1266.
Д. Бесферментные электрохимические иммуносенсоры для определения содержания бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266.
5. Результаты количественного определения бактерий Escherichia coli ATCC
25992 и Staphylococcus aureus B-1266 в модельных смесях и реальных пробах, полученные с использованием разработанных электрохимических иммуносенсоров и подтвержденные в независимой лаборатории методами бактериального посева и ИФА (исследования проведены на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск).
Степень достоверности и апробация работы
Достоверность полученных данных определяется использованием в работе современных физико-химических методов исследования и высокотехнологичного оборудования, а также статистической обработкой полученных результатов . Правильность определения бактерий подтверждена путем сравнения результатов детектирования Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 в модельных смесях и реальных пробах, полученных с использованием разработанных электрохимических иммуносенсоров и методами ИФА и бактериального посева (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», г. Новосибирск).
Результаты исследований, выполненных в рамках данной диссертационной работы, были представлены на всероссийских и международных конференциях: VIII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2012» (Уфа-Абзаково, 2012), всероссийской конференции «Химия и медицина» с молодежной научной школой (Уфа-Абзаково, 2013, 2015), втором съезде аналитиков России (Москва, 2013), конференции «Drug Analysis 2014» (Льеж, Бельгия, 2014), Уральском научном форуме «Современные проблемы органической химии» (Екатеринбург, 2014), конференции «Euroanalysis 2015» (Бордо, Франция, 2015), конференции «Химический анализ и медицина» (Москва, 2015), международной конференции «Recent advances in food analysis» (Прага, Чехия, 2015).
Диссертационная работа является частью исследований, проводимых на кафедре аналитической химии Химико-технологического института УрФУ имени Б. Н. Ельцина в рамках госбюджетной темы Н687.42Г.002/12, грантов РФФИ: 09-О3-12242-офи_м, 14¬03-01017, гранта для молодых ученых У.М.Н.И.К (тема №6 проект 0011038 2015 года).
Публикации. По результатам проведенных исследований опубликованы: 2 статьи в журналах, входящих в базы данных Scopus и Web of Science; получен 1 патент на изобретение; опубликовано 10 тезисов докладов на всероссийских и международных научных конференциях.
Личный вклад автора заключался постановке и проведении научных экспериментов, анализе и систематизации полученных результатов, а также в подготовке научных статей, опубликованных в соавторстве.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, и списка литературных источников (246 источников). Текст диссертационной работы изложен на 150 страницах компьютерной верстки, содержит 32 рисунка и 11 таблиц.
Во введении изложены основные положения об актуальности и степени разработанности темы диссертационной работы, определены цели и задачи исследования, сформулирована научная новизна и практическая значимость, а также положения, выносимые на защиту диссертации.
В первой главе приведены основные достижения в области разработки биосенсоров для определения бактериальных агентов. Особое внимание уделено иммуносенсорам, в которых в качестве метки использованы наноматериалы.
Во второй главе представлены сведения о реактивах, материалах, методологической и инструментальной базе диссертационного исследования.
Третья глава посвящена исследованию характера электропревращений наночастиц магнетита в апротонном растворе, оценке влияния факторов внешней среды на процессы формирования прямого электрохимического отклика от наночастиц и получению аналитического сигнала для дальнейшего использования в электрохимическом иммуноанализе. Обоснована возможность использования наночастиц магнетита в качестве прямой сигналообразующей метки в электрохимическом иммуноанализе.
Четвертая глава включает в себя результаты исследований процессов взаимодействия наночастиц магнетита с бактериальными клетками. Приведены результаты сравнительных испытаний чувствительности планарных платиновых электродов, модифицированных антителами тремя различными способами. Описаны результаты определения целевых бактерий в модельных суспензиях и реальных образцах.
1. Методом соосаждения синтезированы наночастицы Fe3O4, обладающие выраженными магнитными свойствами, используемые в качестве прямых сигналообразующих меток. Средний размер наночастиц составил 10 нм. Полученные наночастицы модифицированы хитозаном и 3-аминопропилтриэтоксисланом. Структура, состав, размеры и форма наночастиц подтверждены методами электронной микроскопии и ИК-спектроскопии.
Получен прямой электрохимический отклик от наночастиц магнетита в апротонной среде. Исследованы особенности процессов электропревращений наночастиц магнетита в апротонных растворах. Предложены схемы протекания исследуемых процессов: Fe3O4+ n-e ^ (Fen+, Fe0) - m-e ^ Fe2+, Fe3+ (n<3; 1
3. Исследована кинетика процессов взаимодействия наночастиц «Fe3O4- хитозан» и <^е3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан» с бактериальными клетками Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 соответственно. Выбрано оптимальное время взаимодействия бактерий с наночастицами (30 минут в случае обнаружения E. coliи 20 минут в случае обнаружения St. aureus).
4. Получены линейные зависимости прямого аналитического сигнала наночастиц, включенных в иммунокомплекс от концентрации бактерий в модельных суспензиях: Q(мКл)=(0,111±0,003)•lgCE.coli■+ (0,053±0,009), Q(мКл)=(0,136±0,002)•lgCst.aureus + (0,086±0,008).
5. Разработаны бесферментные электрохимические иммуносенсоры с использованием в качестве прямой сигналообразующей метки наночастиц «Fe3O4- хитозан» и <^е3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан» для определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 в диапазоне 10 - 105 КОЕ/мл. Предел обнаружения составил: для бактерий Escherichia coli ATCC 25992 - 9,3 КОЕ/мл, для бактерий Staphylococcus aureus B-1266 - 8,7 КОЕ/мл. Относительное стандартное отклонение не превышает 10%.
6. Точность определения бактерий в модельных суспензиях, и реальных пробах подтверждена методами ИФА и бактериального посева.
Получен прямой электрохимический отклик от наночастиц магнетита в апротонной среде. Исследованы особенности процессов электропревращений наночастиц магнетита в апротонных растворах. Предложены схемы протекания исследуемых процессов: Fe3O4+ n-e ^ (Fen+, Fe0) - m-e ^ Fe2+, Fe3+ (n<3; 1
3. Исследована кинетика процессов взаимодействия наночастиц «Fe3O4- хитозан» и <^е3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан» с бактериальными клетками Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 соответственно. Выбрано оптимальное время взаимодействия бактерий с наночастицами (30 минут в случае обнаружения E. coliи 20 минут в случае обнаружения St. aureus).
4. Получены линейные зависимости прямого аналитического сигнала наночастиц, включенных в иммунокомплекс от концентрации бактерий в модельных суспензиях: Q(мКл)=(0,111±0,003)•lgCE.coli■+ (0,053±0,009), Q(мКл)=(0,136±0,002)•lgCst.aureus + (0,086±0,008).
5. Разработаны бесферментные электрохимические иммуносенсоры с использованием в качестве прямой сигналообразующей метки наночастиц «Fe3O4- хитозан» и <^е3О4-3-аминопропилтриэтоксисилан» для определения бактерий Escherichia coli ATCC 25992 и Staphylococcus aureus B-1266 в диапазоне 10 - 105 КОЕ/мл. Предел обнаружения составил: для бактерий Escherichia coli ATCC 25992 - 9,3 КОЕ/мл, для бактерий Staphylococcus aureus B-1266 - 8,7 КОЕ/мл. Относительное стандартное отклонение не превышает 10%.
6. Точность определения бактерий в модельных суспензиях, и реальных пробах подтверждена методами ИФА и бактериального посева.
Подобные работы
- РАЗРАБОТКА ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ ИММУНОСЕНСОРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI И STAPHYLOCOCCUS AUREUS С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАНОЧАСТИЦ Fe3O4 В КАЧЕСТВЕ ПРЯМОЙ СИГНАЛООБРАЗУЮЩЕЙ МЕТКИ
Диссертации (РГБ), химия. Язык работы: Русский. Цена: 4315 р. Год сдачи: 2016 - РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА КОРИ В МОДЕЛЬНЫХ И РЕАЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ
Магистерская диссертация, химия. Язык работы: Русский. Цена: 5500 р. Год сдачи: 2017 - ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ЭЛЕКТРОГРАФТИНГА В
ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОМ ИММУНОАНАЛИЗЕ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К SALMONELLA TYPHIMURIUMII ВИРУСУ КОРИ
Магистерская диссертация, химия. Язык работы: Русский. Цена: 5500 р. Год сдачи: 2018 - РАЗРАБОТКА ИММУНОСЕНСОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ESCHERICHIA COLI И АНТИГЕНА ВИРУСА КОРИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАНОКОМПОЗИТОВ НА ОСНОВЕ Fe3O4
Диссертации (РГБ), химия. Язык работы: Русский. Цена: 4290 р. Год сдачи: 2015 - ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ОРГАНИЧЕСКИХ И НЕОРГАНИЧЕСКИХ НАНОРАЗМЕРНЫХ МОДИФИКАТОРОВ ДЛЯ БЕСФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Диссертации (РГБ), химия. Язык работы: Русский. Цена: 4255 р. Год сдачи: 2018 - ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ОРГАНИЧЕСКИХ И НЕОРГАНИЧЕСКИХ НАНОРАЗМЕРНЫХ МОДИФИКАТОРОВ ДЛЯ БЕСФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Авторефераты (РГБ), химия. Язык работы: Русский. Цена: 4365 р. Год сдачи: 2018